Regulation of gene expression and cell proliferation by AhR ligands in liver cell lines

Mgr. Petra Brenerová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Polychlorované dibenzo-p-dioxiny (PCDD) včetně 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinu (TCDD), polychlorované dibenzofurany (PCDF) a polychlorované bifenyly (PCB) představují skupinu persistentních sloučenin v životním prostředí a jsou to nejvíce toxické polyaromatické uhlovodíky. Biologické a toxické efekty těchto sloučenin jsou zprostředkovány přes receptor pro aromatické uhlovodíky (AhR), což je ligandem aktivovaný transkripční faktor a člen rodiny basic-helix-loop-helix-PAS (bHLH-PAS) transkripčních faktorů. V cytosolu se AhR nachází volně bez ligandu v komplexu se dvěma molekulami heat-shock proteinu 90 a s alespoň jedním homologním proteinem imunofilinem. Po vazbě ligandu na AhR dochází k jeho translokaci do jádra a rozdělení cytosolového komplexu. Následně dochází k heterodimerizaci s translokátorem pro receptor aromatických uhlovodíků (ARNT) a heterodimér AhR/ARNT se váže na dioxinové responsní elementy (DREs), také známé jako xenobiotické responsní elementy (XREs). Vazba tohoto heterodiméru aktivuje expresi genů podílejících se na první a druhé fázi biotransformace, jsou to například CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, GST 2 a NADPH chinonoxidoreduktasa. Nedávno bylo identifikováno mnoho dalších cílových genů tohoto receptoru, což naznačuje mnohem širší roli AhR ve vývoji tkáně a nežádoucích účinků, jako je rakovina. TCDD je jeden z nejtoxičtějších polyaromatických uhlovodíků (PAU), které se běžně vyskytují a znečišťují životní prostředí. TCDD je široce rozšířený kontaminant v životním prostředí, který způsobuje celou řadu druhově a orgánově specifických biologických účinků. Epidemiologické studie naznačují, že TCDD je lidský karcinogen. A je známo, že efekty TCDD jsou zprostředkovány právě vazbou na receptor pro aromatické uhlovodíky. PCB jsou skupinou hydrofóbních chlorovaných sloučenin, vyznačujících se vysokou persistencí, toxicitou, bioakumulací a široce rozšířenou distribucí v životním prostředí. Biologické účinky individuálních PCB kongenerů silně závisí na počtu a pozici atomů chlórů. Ne-ortho substituované a mono-ortho substituované koplanární PCB (DL-PCB) jsou známy tím, že vyvolávají řadu nežádoucích účinků, spojené s aktivací AhR, včetně reprodukční toxicity, dermatotoxicity, imunotoxicity, vývojové toxicity, neurotoxicity, karcinogeneze a hepatotoxicity. Di-ortho substituované PCB , označované „non-dioxin-like“ sloučeniny (NDL-PCB), vykazují odlišné spektrum toxických mechanismů účinku, jako jsou neurotoxicita, imunotoxicita, endokrinní disrupce a nádorová promoce. Cílem naši práce bylo charakterizovat AhR-zprostředkované efekty v krysí jaterní progenitorové buněčné linii WB-F344 a v některých dalších jaterních buněčných modelech. Bylo naznačeno, že jaterní progenitorové (oválné) buňky by mohly představovat potenciální cíl pro chemikálie, které způsobují hepatokarcinogenezi. Prvně jsme studovali AhR-řízené dráhy v globální genové expresi po expozici koplanárním PCB 126 (3,3', 4,4', 5-pentachlórbifenylem) v kontaktně inhibovaných WB-F344 buňkách po 6, 24 a 72 hodinách. Identifikovali jsme řadu cílových AhR genů ( tj. Ptgs2, Fst, Areg, Hbegf, Btg2 and Foxq1), potencionálně zapojených do nádorově promočních procesů, jako je indukce proliferace a poškození buněčné komunikace. Na základě dat z analýzy globální genové exprese jsme se dále zaměřili na účinky TCDD na expresi Hippo transkripčních cílů, zejména na survivin v krysí jaterní progenitorové linii WB-F344. Navíc jsme pozorovali expresi survivinu také v modelu lidských jaterních buněk, HepaRG. Zjistili jsme, že survivin, který hraje roli v buněčné proliferaci a inhibici apoptosy, by mohl být nepřímo indukován aktivovaným AhR, a to by mohlo hrát roli v

Abstract:

AhR-depnedentní proliferaci kontaktně inhibovaných WB-F344 buněk. Relativní potence koplanárních PCB podobných dioxinům (DL-PCBs) a dalších sloučenin podobných dioxinům, které aktivují AhR a způsobují AhR-závislé toxické účinky, jsou základní pro posouzení rizik. Studie sledující závislost dávka vs. odpověď byla provedena v krysí jaterní progenitorové linii WB-F344 za použití několik AhR cílových genů jako parametrů aktivace AhR a míry dioxinové toxicity. Vzhledem k tomu že aktivace AhR a AhR-závislá toxicita může být buněčně, tkáňově a druhově specifická, naše data byla porovnávána v dalších in vitro modelech u lidí a hlodavců a hodnoty tzv. „konsensuálních toxických faktorů“ (CTFs) byly hodnoceny QSAR technikami. Hodnotili jsme také potenciální tlumivé účinky NDL-PCBs na aktivaci AhR, s použitím sady 24 čistých NDL-PCB kongenerů. V této studii jsme zkoumali antagonistické účinky NDL-PCB kongenerů v kombinaci s expozicí PCB 126, který indukuje aktivaci AhR a je nejúčinnější koplanární PCB (0.1toxické účinnosti TCDD). Stanovili jsme vliv hlavních NDL-PCB na model AhR-závislé luciferázové reportérové genové exprese v krysích hepatoma buňkách. A dalším zkoumaným parametrem závislým na aktivovaném AhR bylo narušení kontaktní inhibice v krysích jaterních epiteliálních buňkách. Bylo zjištěno, že některé NDL-PCB by mohly regulovat odpovědi podobné dioxinům a tedy i celkově účinky v komplexních směsích.

Abstract:

Polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs), polychlorinated dibenzofurans (PCDFs), and polychlorinated biphenyls (PCBs) constitute a group of persistent environmental chemicals, with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) being the most toxic of polyhalogenated aromatic hydrocarbons. Biological and toxic effects of these compounds are mediated through the aryl hydrocarbon receptor (AhR), a ligand-activated transcription factor that is a member of the basic-helix-loop-helix-PAS (bHLH-PAS) family of transcription factors. In the cytosol, the unliganded receptor forms a complex with two heat-shock-protein 90 molecules and at least one immunophilin homologous protein. Binding of the ligand results in nuclear translocation of the AhR and disruption of the complex. After heterodimerization with aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), the AhR/ARNT heterodimer binds to dioxin responsive elements (DREs), also known as xenobiotic responsive elements (XREs). Binding of the AhR/ARNT activates the expression of battery of genes involved in I and II phase of detoxification, such as CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, GST 2 and NADPH quinone oxidoreductase. Many other target genes have been reported recently, suggesting a much broader role of AhR in tissue development and adverse effects such as carcinogenesis. TCDD is the most toxic of a family of related polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) that are common environmental contaminants. TCDD is widespread environmental contaminant causing a variety of species and organ-specific biological effects. Epidemiological studies indicate that TCDD is human carcinogen. The known cellular actions of TCDD are mediated by binding to the AhR. PCBs are a group of hydrophobic chlorinated compounds characterized by high persistence, toxicity, bioaccumulative properties and widespread distribution in the environment. The biological effects of individual PCB congeners strongly depend on the number and position of chlorine atoms. The non-ortho- and mono-ortho-substituted coplanar PCBs are known to elicit a set of adverse „dioxin-like” effects associated with the activation of the AhR, including reproductive toxicity, dermatotoxicity, immunotoxicity, developmental toxicity, neurotoxicity, carcinogenensis and hepatotoxicity. Di ortho-substituted PCBs, termed as non-dioxin-like PCBs (NDL-PCBs), exhibit a different spectrum of toxic modes of action, including neurotoxicity, immunotoxicity, endocrine disruption or tumor promotion. The aim of our work was to characterize AhR-mediated signaling in rat liver progenitor cells WB-F344 and in some other cellular hepatic models. Liver progenitor (oval) cells have been suggested to constitute a potential target for hepatocarcinogenic chemicals. At first we studied AhR-driven pathways in global gene expression in response to exposure to coplanar PCB 126 (3,3', 4,4', 5-pentachlorobiphenyl) in contact inhibited WB-F344 cells after 6, 24 and 72 h treatment. We identified a number of AhR target genes (i.e. Ptgs2, Fst, Areg, Hbegf, Btg2 and Foxq1) potentially involved in tumor promotion processes such as induction of proliferation and disruption of cell-cell communication. Based on data from global gene expression analysis, we further focused on the effects of TCDD on expression of Hippo transcriptional targets, in particular survivin in rat liver progenitor cell line, WB-F344. Moreover we observed expression of survivin also in a model of human liver cells, HepaRG. We found that survivin, which plays a role both in cell proliferation and inhibition of apoptosis, could be indirect target of AhR activation and it plays a role in proliferation of contact-inhibited WB-F344 cells after activation of the AhR. The relative potencies of dioxin-like coplanar polychlorinated biphenyls (DL-PCBs) and other dioxin-like compounds to activate the AhR and to cause the AhR-dependent toxic effects are essential for the risk assessment. Dose-response study was performed in rat liver p

Abstract:

rogenitor WB-F344 cells, using several AhR-target genes as the specific end-points of the AhR activation. Due to the fact, that AhR activation and AhR-dependent toxicity might be cell-, tissue- and species-specific, our data were compared with series of other human and rodent in vitro models and consensus toxicity factors (CTFs) were evaluated by QSAR techniques. We evaluated also potential suppressive effects of NDL-PCBs on AhR activation, using the set of 24 pure NDL-PCBs. In the present study, we investigate the antagonistic effect of NDL-PCBs on induction of AhR-mediated activities induced by PCB 126, a most potent coplanar PCB, having one-tenth the toxic potency of TCDD. We determined impact of NDL-PCBs on the model AhR-dependent luciferase reporter gene expression in rat hepatoma cells. Disruption of contact inhibition, as another parameter dependent on activated AhR, was studied in rat liver epithelial cells. It was found that some NDL-PCBs could modulate dioxin-like response and therefore also overall dioxin-like effects in complex mixtures.

Keywords

aryl hydrocarbon receptor, 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, gene expression, cell proliferation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 23. 9. 2016
• Supervisor: RNDr. Miroslav Machala, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et Ph.D., prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry