Prase jako experimentální model pro studium orofaciální oblasti

MUDr. Jan Štembírek, Ph.D.

Doctoral thesis

The pig as an experimental model for the study of the orofacial region

Abstract:

Prase jako experimentální model pro studium orofaciální oblasti. Prase domácí, které se po stránce morfologické i fyziologické podobá v mnoha ohledech člověku, představuje velmi dobře použitelný modelový organismus. Z tohoto důvodu je, zvláště v poslední době, velmi často využíváno jako biomedicínský model pro široké spektrum výzkumu. Navzdory tomu, že velká podobnost heterodontního difyodontního chrupu prasete k člověku jej přímo předurčuje jako model pro výzkum morfogeneze zubů, o vlastním vývoji chrupu u prasete je dostupných jen velmi málo informací. Cílem naší studie bylo prozkoumat raná stadia odontogeneze prasete od zahájení vývoje dočasných zubů do pozdní fáze zvonku, kdy se začíná formovat sekundární zubní lišta. Pro analýzu zubních zárodků a strukturálních změn zubní lišty jsme zvolili trojrozměrnou obrazovou analýzu. V nejranějším stádiu byla na 3D rekonstrukci patrná kontinuální zubní lišta probíhající podél celé délky čelisti. Později začaly být na zubní liště v různých oblastech znatelné rozdíly v tloušťce. Zubní lišta začala vrůstat v linguálním směru do mezenchymu a toto vrůstání bylo zdůrazněno asymetrickou proliferací buněk. Po přechodu zárodků primárních zubů do pozdní fáze zvonku se zubní lišta začala rozpadat. První známkou této fragmentace byla ztráta bazální membrány, což epitelovým buňkám umožnilo uvolnění od lišty a migraci do okolního mezenchymu. Buňky vykazovaly sníženou expresi epitelových markerů (E-cadherin, cytokeratin), naopak exprese mezenchymálních markerů (Slug, MMP2 a vimentin) byla zvýšená. Reziduální buňky lišty byly odstraňovány apoptózou. Zatímco většina buněk během rozpadu zubní lišty zanikla, některé zůstaly přítomny ve formě malých ostrůvků označovaných jako epitelové perly. Poznání procesů souvisejících s vývojem zubní lišty a zubů nám může objasnit vývoj difyodoncie a mechanismů, jejichž další výzkum by v budoucnosti mohl vést až k experimentům s počtem generací zubů. Výsledky mohou být rovněž použity pro sledování osudu epitelových perel počínaje jejich vznikem až po jejich roli ve formování případných patologických struktur v čelistech. V rámci této dizertační práce byla provedena i studie zaměřená na osud autologní krve injikované do temporomandibulárního kloubu (TMK). Injekce autologní krve do TMK byla v poslední době úspěšně používána v léčbě recidivující kondylární dislokace. Obecně uznávaná teorie, vysvětlující úspěch této terapeutické metody, předpokládá, že aplikace autologní krve vyprovokuje vznik aseptického zánětu doprovázého srůsty, nicméně přesný mechanismus probíhajícího procesu po léčebném zákroku dosud popsán nebyl. V rámci naší studie jsme využili prase domácí jako modelový organismus pro aplikaci autologní krve do TMK. Efekt této aplikace byl sledován pomocí magnetické rezonance, dále pak makroskopickým vyšetřením a histologickou analýzou. Při hodnocení jednu hodinu a jeden týden po injikaci autologní krve byly v horní kloubní dutině patrné depozice krevních zbytků. Po dvou týdnech byly v distálních částech horní kloubní dutiny pozorovatelné drobné kousky krevní sraženiny a po čtyřech týdnech od zákroku již na vnitřní straně TMK nebyly patrné ani zbytky sraženiny, ani žádné jiné změny či srůsty. Stejně tak nebyly pozorovány žádné morfologické či histologické změny. Z těchto poznatků vyplývá, že v úspěšné terapii hypermobility TMK aplikací autologní krve pravděpodobně hraje roli jiný mechanismus, než byl námi předpokládán.

Abstract:

In recent craniofacial research, the most common mammalian model is the mouse. However, due to some different anatomical and physiological arrangements, extrapolation to human becomes often difficult. Therefore, the pig (or minipig), which is similar to humans in many more aspects, represents a promising model. One of challenging areas for use of a pig model is odontogenesis as the pig has diphyodont and heterodont dentition resembling that of humans. So far, only limited information is available about the processes of tooth development in the pig. Thus, the main purpose of this study was to classify odontogenesis in the minipigs from the initiation of deciduous dentition to the late bell stage when the successional dental lamina begins to develop. To analyze the initiation of teeth anlagens and structural changes of the dental lamina, a comprehensive three-dimensional (3D) analysis was performed. The second aspect of this investigation was the mechanism of dental lamina degradation as this structure is necessary for the development of both primary and secondary generations of teeth. The lamina is therefore considered as one of important factors governing number of tooth generations. Along with morphology, specific markers of adhesion, migration and apoptosis were examined to tackle dental lamina investigation. Lamina regression starts with the loss of the basement membrane, allowing the epithelial cells to break away from the lamina and migrate into the surrounding mesenchyme. Cells deactivated epithelial markers (E-cadherin, cytokeratin), up-regulated Slug and MMP2, and activated mesenchymal markers (vimentin), while residual lamina cells were removed by apoptosis. The uncovering of the processes behind development of dental lamina and tooth allows us to clarify the evolution of diphyodont animals, and reveals a mechanism, the further studies of which can lead to future manipulation of the number of tooth generations. Apart of dentition, the pig model appears to be useful also for studies related to temporomandibular joint. In this field, the pig was tested in a research experiment focused on the fate of autologous blood injected into the temporomandibular joint (TMJ), a therapy commonly used in human medicine. Magnetic resonance imaging (MRi), macroscopic and histological analyses were used for evaluation of results. Deposition of blood remnants was observed in the form of clots, however, no morphological or histological changes were observed in the TMJ following the injection of the autologous blood, which suggests that other mechanisms must be involved in the hypermobility treatment effect. The presented work introduced the pig as a suitable model species, which was used to address some challenging questions in three different research areas and confirmed importance of such model in recent basic and medical craniofacial research. The pig as an experimental model for clinical craniofacial research was reviewed in an IF paper presented in the end of the thesis.

Keywords

prase, zubní lišta, epitelo-mesenchymální transformace, temporomandibulární kloub, hypermobilita pig, dental lamina, epithelial-mesenchymal transformation, temporomandibular joint, hypermobility.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2013
• Supervisor: doc. MUDr. Lenka Roubalíková, Ph.D., prof. MVDr. Ivan Míšek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Dentistry (4-years) / Dentistry