Sledování vybraných polutantů a matabolitů léčiv v rybách

Mgr. Samuel Mach, Ph.D.

Doctoral thesis

Monitoring of Selected Pollutants and Matabolites of Pharmaceuticals in Fish

Abstract:

Cílem této práce je přinést nové poznatky v oblasti expozice ryb cizorodými látkami uvolňovanými do prostředí člověkem. Byly použity dva různé přístupy: 1. Sledování jedné zvláštní skupiny kontaminantů, hlavních isomerů hexabromocyklododekanu (HBCD), v rybách získaných z Polského trhu. Toto sledování přispělo k pochopení nekontrolovatelného šíření nezáměrně uvolňovaných chemikálií a následné kontaminace potravních řetězců, které nakonec končí zpátky u člověka. Byla upravena vhodná analytická metoda zahrnující přípravu vzorků, instrumentální analýzu (HPLC/MS/MS) a jištění a kontrolu kvality. Vzorky byly analyzovány touto metodou. Byl studován vztah mezi jednotlivými isomery HBCD a jejich koncentracemi v rybách a vztah mezi celkovým obsahem HBCD a obsahem tuku. 2. Sledování metabolitů dvou účinných léčivých substancí (anglická zkratka API = active pharmaceutical ingredient) vzniklých v laboratorních podmínkách v modelovém druhu, Ameiurus Nebulosus.Obě tyto účinné látky, obeticholová kyselina (OCA) a abirateron acetát, mají steroidní skelet. OCA je navíc svojí podstatou syntetický derivát v přírodě se vyskytující žlučové kyseliny (6-a-ethyl- derivát chenodeoxycholové kyseliny). Obě účinné látky se v současné době uvádějí na trh. Můžeme je označit jako nové polutanty. Toto sledování přispělo k pochopení metabolismu těchto účinných látek v rybách. V diskuzi bylo provedeno srovnání s metabolismem těchto účinných látek u člověka a jiných savců a s metabolismem jiných steroidních látek v rybách. V případě OCA, byl srovnán také metabolismus přírodních žlučových kyselin u člověka, u jiných savců a u ryb. Experimentální uspořádání zahrnovalo zavedení jednotlivých účinných látek rozpuštěných v olivovém oleji za užití žaludkové sondy do ryb a po třech dnech extrakci vody, ve které byly ryby ponechány. Tento postup se ukázal jako velmi snadná a účinná metoda pro získání metabolitů aplikovaných účinných látek. V případě OCA byla také analyzována rybí žluč. Byly vyvynuty instrumentální metody. Pro metabolity OCA to byla metoda UPLC/HRMS, charakterizovaná velkou selektivitou vycházející z úzkého detekčního okna umožněného vysokým rozlišením. Pro metabolity abirateronu acetátu to byla metoda HPLC/MS/MS, která poskytuje navíc určitou strukturní informaci o analytech na základě pozorovaných fragmentů. Metabolity byly identifikovány na základě shody jejich hodnot m/z; pokud byl k dispozici standard určitého metabolitu, také na základě shody retenčního času se standardem. Pro jednoho z převažujících metabolitů abirateronu acetátu bylo provedeno stanovení straktury pomocí NMR. Pokud jde o OCA, identifikované metabolity mohou být rozděleny do dvou skupin. První skupina představuje metabolity typické pro metabolismus žlučových kyselin. Vedle běžných konjugátů s taurinem a glycinem, byl detekován také keto-derivát a konjugát s D-cysteinovou kyselinou, což je pravděpodobně specificky rybí metabolit. Druhá skupina představuje typické dráhy primárního a sekundárního metabolismu steroidů. To je sulfát, glukuronid a několik hydroxy-derivátů. Pokud jde o abirateron acetát, byly identifikovány očekávané metabolity jak primární (produkty hydroxylace) tak sekundární (produkty sulfatace a glukuronidace). Byl učiněn nečekaný objev: struktura převažujícího metabolitu, o kterém se předpokládalo, že je jedním z možných hydroxy-derivátů, byla pomocí NMR určena jako abirateron-16,17-epoxid. Bližší analýza MS2 a MS3 spekter ukázala, že také jeden z předpokládaných hydroxy-abirateronů acetátů a některé sekundární metabolity jsou pravděpodobně 16,17-epoxidy.

Abstract:

The aim of this thesis is to bring new insight in the field of exposition of fish to xenobiotics released by humans. Two different perspectives were used: 1. Monitoring of one special group of contaminants, hexabromocyclododecane (HBCD) predominant isomers, in fish obtained from polish fish market. This monitoring contributed to understanding of uncontrollable spreading of unintentionally released chemicals and consequent contamination of food web ending finally in humans. A suitable analytical method including sample preparation, instrumental analysis (HPLC/MS/MS) and quality assurance and controll was adjusted. Samples were analysed by this method. Relationship among individual HBCD isomers and their concantrations in fish and relationship between level of total HBCD content and lipid content were discussed. 2. Monitoring of metabolites of 2 APIs (active pharmaceutical ingredients) formed in laboratory conditions in model fish species, Ameiurus Nebulosus. Both APIs, obeticholic acid (OCA) and abirateron acetate (ABR-acetate), have steroid skeleton. OCA, in addition, is by nature a synthetic derivative of a naturally occuring bile acid (6-alpha-ethyl-derivative of chenodeoxycholic acid). Both APIs are currently being introduced into the market. They can be classified as emerging pollutants. This monitoring contributed to understanding of metabolism pathways of these special APIs in fish. Comparison with metabolism of these APIs in humans and other mammals and with metabolism of other steroids in fish was discussed, in case of OCA also comparison with metabolism of naturally occuring bile acids both in humans and other mammals and fish. Experimental setup included feeding of fish by individual APIs dissolved in olive oil via gastric probe and after three days extraction of water used for the fish breeding. This procedure proved to be a very simple and efficient method for obtaining metabolites of administered APIs. In case of OCA fish bile was also analysed. Methods for instrumental analysis were developed. For OCA metabolites it was UPLC/HRMS method characterized by high selectivity originating from narrow detection window enabled by high resolution. For ABR-acetate metabolites it was HPLC/MS/MS method providing also some structural information about analytes from fragments observed. Metabolites were identified based on agreement of their m/z values, when a standard of a specific metabolite was available, also on agreement of retention time with the standard. For one of the prevailing metabolites of ABR-acetate NMR structure determination was done. As for OCA, the metabolites identified can be devided into two groups. The first group represents metabolites typical for bile acids metabolism. Beside the most common taurine and glycine conjugates also keto-derivative and the d-cysteinolic acid conjugate, likely a metabolite specific to fish, were detected. The second group represents typical pathways of primary and secondary steroid metabolism. These are sulfate, glucuronide, and several hydroxy-derivatives. As for ABR-acetate, expected both primary (products of hydroxylation) and secondary (products of glucuronidation and sulphatation) metabolites were identified. An unexpected finding was made: NMR measurement of one of the prevailing metabolites presumed to be one of possible hydroxy-derivatives discovered that it is not hydroxy-derivative but abiraterone-16,17-epoxide. Closer analysis of MS2 and MS3 spectra revealed that one of presumed hydroxy-ABR-acetates and also some secondary metabolites are probably 16,17-epoxides.

Keywords

food contaminants, pharmaceuticals, metabolites, fish, LC–MS, kontaminanty v potravinách, léčiva, metabolity, ryby

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2019
• Supervisor: doc. RNDr. Zdeněk Šimek, CSc.
• Reader: prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr., RNDr. Andrea Vojs Staňová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry