Molekulární a fenotypová charakterizace vybraných HvMPK3 knockout a HvMPK3 nadprodukčních transgenních linií ječmene

Bc. Eva TREJTNAROVÁ

Bachelor's thesis

Molecular and phenotypic characterization of selected HvMPK3 knockout and HvMPK3 overexpression transgenic barley lines

Abstract:

Tato bakalářská práce se zabývá genotypovou a fenotypovou charakterizací transgenních linií ječmene setého (Hordeum vulgare) odrůdy Golden promise se zvýšenou expresí genu HvMPK3 a s vyřazeným genem HvMPK3 (knockout). S využitím polymerasové řetězové reakce byla u transgenních rostlin ověřena přítomnost T-DNA kazety, a to pomocí specifických PCR markerů charakteristických pro daný konstrukt. Vybrané rostliny se zvýšenou expresí genu HvMPK3 byly podrobeny Multiplex TaqMan qPCR analýze, která umožnila predikovat transgenní genotyp u těchto rostlin. V práci byly identifikovány transgenní linie s nadprodukcí HvMPK3, které obsahovaly jednu kopii T-DNA/případně tandemově inzerované kopie T-DNA a také homozygotní jedinci v T-DNA inzerci v rámci těchto linií. Vybraní jedinci s vyřazeným genem HvMPK3 byli charakterizováni pomocí sekvenační analýzy. Výsledky této analýzy vedly k identifikaci jedinců s homozygotními mutacemi, které způsobují posun čtecího rámce genu HvMPK3. V následující generaci rostlin byla přítomnost těchto homozygotních mutací potvrzena. Ověřena byla také spolehlivost genotypování transgenních rostlin ječmene pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Měření dynamiky ztráty vody neukázalo žádné rozdíly mezi transgenními rostlinami a kontrolními rostlinami. Při sledování dynamiky vadnutí rostlin se zdály být rostliny s vyřazeným genem HvMPK3 odolnější vůči působení vodního deficitu oproti rostlinám se zvýšenou expresí genu HvMPK3.

Abstract:

This bachelor thesis deals with the genotypic and phenotypic characterization of transgenic lines of barley (Hordeum vulgare) cv. Golden Promise in which the HvMPK3 gene was overexpressed and knocked out. Polymerase chain reaction was carried out to verify the presence of the T-DNA cassettes in these plants by using specific PCR markers for each construct. Selected plants overexpressing HvMPK3 were subjected to the Multiplex TaqMan qPCR analysis in order to predict the transgenic genotype of these plants. Transgenic lines were identified, which contained one copy of T-DNA or tandem T-DNA insertions, as well as individual plants homozygous in T-DNA insertion. Selected plants in which HvMPK3 gene was knocked out were characterized by sequence analysis. Results of this analysis led to the identification of the individual plants with homozygous frameshift mutations in the HvMPK3 gene. In the subsequent generation of plants, the presence of these homozygous mutations was confirmed. Furthermore, the reliability of simple genotyping of transgenic plants with in vitro hygromycin resistance test was verified. The measurements of water lost dynamic showed no differences between transgenic and control plants. When wilting dynamic was monitored, HvMPK3 knockout plants appeared to be more resistant to drought stress than plants overexpressing HvMPK3 gene.

Keywords

HvMPK3, ječmen setý (Hordeum vulgare), sucho, transgenní rostliny, hygromycinová rezistence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2018
• Supervisor: Ing. Pavel Křenek, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering