Metódy detekcie a kvantifikácie včelieho vitellogenínu

Bc. Eva HRTÁNKOVÁ

Diplomová práce

Methods for detection and quantification of honey bee vitellogenin

Anotace:

Diplomová práca je zameraná na štúdium včelieho proteínu vitellogenínu (Vg), ktorý zohráva kľúčovú úlohu v regulácii života a sociálneho usporiadania včely medonosnej (Apis mellifera). V teoretickej časti sú zhrnuté doterajšie poznatky o Vg všeobecne, ich syntéze, pôsobení a výskyte so zameraním na hmyz. Druhá časť literárnej rešerše je venovaná včeliemu Vg, jeho štruktúre a špecifickým funkciám v kontexte regulácie života včiel a včelieho spoločenstva. Záver teoretickej časti obsahuje prehľad metód využívaných pre purifikáciu Vg a vitellínov. Praktická časť je zameraná na imunochemickú detekciu Vg v rôznych telových častiach zimných včiel a následne na optimalizáciu jeho purifikácie pomocou nízkotlakovej kvapalinovej chromatografie. Detekcia metódou Western blot potvrdila prítomnosť Vg v mozgu, hltanových žľazách, hlave, hrudníku, tukovom teliesku a hemolymfe zimných včiel. V rámci purifikácie boli optimalizované vhodné podmienky pre chromatografiu na anexe. Najlepšie výsledky boli dosiahnuté s využitím 10× riedenej hemolymfy zimných včiel odoberanej do malého množstva fenyltiomočoviny. Ako ekvilibračný pufor bol zvolený 30 mmoll-1 trietanolamín/HCl (pH 8) a ako elučný pufor 30 mmoll-1 trietanolamín/HCl s prídavkom 1 moll-1 NaCl (pH 8). Elúcia Vg prebiehala s využitím lineárneho gradientu pri prietoku 0,8 mlmin-1 medzi 40-50 minútou. Ďalší postup bol venovaný finálnemu prečisteniu získaného Vg pomocou afinitnej chromatografie na konkanavalíne A, a tiež gélovej permeačnej chromatografii pre odstránenie proteínov s podobným pI a odlišnou molekulovou hmotnosťou, avšak optimalizácia posledných dvoch typov chromatografií nebola z časových dôvodov dokončená. Získané výsledky poslúžia ako základ pre ďalší výskum Vg a jeho vlastností.

Abstract:

This thesis focuses on the study of the bee protein vitellogenin (Vg), which plays a key role in the regulation of life and social organization of the honey bees (Apis mellifera). Theoretical part summarizes the current knowledge on Vg, their synthesis, biological function and occurrence in organism with a focus on insects. The second part of the theoretical part is devoted to bee Vg, its structure and specific functions. At the end of the theoretical part there is an overview of methods used for purification of Vg and vitellins. The experimental part is focused on the immunochemical detection of Vg in different body parts of winter bees and subsequently on the optimization of its purification by low-pressure liquid chromatography. Detection by Western blot confirmed the presence of Vg in the brain, hypopharyngeal glands, head, thorax, fat body and haemolymph of winter bees. Regarding to purification, appropriate conditions for chromatography on a HiTrap ANX Sepharose FF 1ml column (Cytiva, USA) were optimized. The best results were obtained using 10-fold diluted hemolymph of winter bees sampled in a solution of presence a small amount of phenylthiourea 30 mmoll-1 triethanolamine/HCl was chosen as the most suitable equilibration buffer and 30 mmoll-1 triethanolamine/HCl with the addition of 1 moll-1 NaCl as the elution buffer. The elution of Vg was carried out using a linear gradient at a flow rate of 0.8 mlmin-1 between 40-50 min. A further procedure was dedicated to the final purification of the obtained Vg using affinity chromatography (HiTrap Con A 4B 1 ml, Cytiva, USA), and also to the removal of proteins with similar pI and different molar mass by using gel permeation chromatography, however this optimization was not completed due to time constraints. The results obtained will serve as a basis for further research on Vg and its properties.

Klíčová slova

Apis mellifera, vitellogenín, nízkotlaková kvapalinová chromatografia, glykoproteíny, dlhovekosť

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 21. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Silvie Dostálková, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie