Stanovení vybraných mezenchymových markerů v oocyty obklopujících buňkách

Bc. Kristýna Bajgarová

Diplomová práce

Chosen mesenchymal markers determination in oocytes surrounding cells

Anotace:

V této práci byla optimalizována metodika stanovení exprese mezenchymových markerů v kumulárních buňkách člověka a prasete. Zaměřili jsme se na detekci proteinů CD44 a CD105, endoglinu. V obou typech kumulárních buněk jsme detekovali oba proteiny. Primární protilátky byly nejprve ředěny podle doporučení výrobce (CD44 v poměru 1:2000, CD105 1:1000), ale signál byl příliš slabý, proto pro další detekce proteinů byla zvýšena koncentrace protilátek (CD44 1:1000 a CD105 1:500), kdy měl detekovaný signál už dostatečnou intenzitu. Sekundární protilátka byla ředěna v poměru 1:3000. Proteiny s navázanou protilátkou byly následně za použití chemiluminiscenčního substrátu detekovány pomocí přístroje Azure c600.Síla signálu reakce antigenu s protilátkou proti hledanému proteinu na blotu byla vyjádřena na základě parametru integrované optické denzity (IOD), která je rovna součinu průměrné optické denzity a plochy v místě reakce antigenu s protilátkou. Aby bylo možné porovnat množství daného proteinu v kumulárních buňkách, byly hodnoty integrované optické denzity vztaženy k hodnotě integrované optické denzity proteinu tubulinu v příslušném typu kumulárních buněk. Tímto způsobem byla získána relativní integrovaná optická denzita (RIOD), která byla v případě tubulinu v kumulárních buňkách člověka i prasete rovna hodnotě 1. Tubulin byl zvolen jako referenční protein, protože se vyskytuje ve všech eukaryotických buňkách. V porovnání s tubulinem se v kumulárních buňkách člověka i prasete vyskytuje srovnatelné množství CD44, proteinu CD105 endoglinu je méně.V další fázi experimentů budou kumulární buňky člověka a prasete kultivovány. Během kultivace bude sledován jejich vývoj, proliferační aktivita a viabilita. Následně budou jednotlivé subpopulace buněk hodnoceny z hlediska jejich diferenciace a proliferace. Pro tento postup bude využito právě stanovení charakteristických mezenchymových markerů, jako jsou CD44, CD105 endoglin a dále například CD29-B1 integrin a rovněž markery proliferace, jako je například CD71 – transferrin R a receptory pro gonadotropní hormony.

Abstract:

In this thesis the metodology of mezenchymal markers determination in human and porcine cumulus cells was optimized. We focused on protein detection of CD44 and CD105, endoglin.Both proteins were detected in both types of cumulus cells. Primary antibodies were diluted according to the manufacturer's recommendations (CD44 in a ratio 1:2000, and CD105 in a ratio 1:1000, both antibodies were diluted with 5% non-fat dry milk), but detected signal was too weak, so for further detection the concentration of primary antibodies was increased (CD44 1:1000 and CD105 1:500). After that, the detected signal was sufficient. Secondary antibody was diluted in a ratio 1:3000. Proteins with bounded antibody were then detected by chemiluminiscent substrate with Azure c600 machine. The intesity of the signal from antigen-antibody reaction on the membrane was expressed by Integrated Optical Density (IOD), which is equal to an average optical density multiply to area in the place of a reaction of antigen with antibody. For comparison of the protein amount in cumulus cells, we applied values of integrated optical density of protein to value of integrated optical density of tubulin α in cumulus cells. Relative integrated optical density (RIOD) was obtained, in case of human and pig RIOD was equal to 1. Tubulin was chosen as referential protein because of its occurrence in all euaryotics cells. Compared to tubulin, comparable amounts of CD44 and less amounts of CD105 endoglin were found in both human and pig cumulus cells.In next phase of experiments human and porcine cumulus cells will be cultured. While being cultured proliferative activity and viability will be tested. Each subpopulation of cumulus cells will be evaluated according to differentiation and proliferation. The determination of characteristic mezenchymal markers, such as CD44 and CD105 (endoglin) and furthermore CD29-B1-integrin and markers of proliferation, such as CD71-transferrin R and receptors of gonadotropin hormones will be used for the evaluation of cells.

Klíčová slova

člověk, prase, kumulární buňky, detekce proteinů, Western blot

Keywords

human, pig, cumulus cells, protein detection, Western blot

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie