Analýza teplotně senzitivních mutantů nádorového supresoru p53

Bc. Jana Jagošová

Master's thesis

Analysis of temperature-dependent mutants of tumor suppressor p53

Abstract:

Protein p53 je nádorový supresor, který hraje velmi důležitou roli při udržování genomové stability. Pokud je buňka vystavena některému ze stresových faktorů, dochází k rychlé stabilizaci a aktivaci proteinu p53. Aktivovaný protein p53 se může následně podílet např. na zastavení buněčného cyklu či na zahájení apoptózy. Somatické mutace TP53 jsou zaznamenány u 50% nádorových onemocnění. Většinu somatických mutací TP53 tvoří bodové mutace DNA-vazebné domény. Následkem bodové mutace genu TP53 vzniká v nádorových buňkách mutantní protein, jehož funkce a vlastnosti se od standardního proteinu p53 liší v závislosti na charakteru mutace. Tato práce se zabývá studiem funkčních vlastností teplotně závislých (td) mutantů p53. Teplotně závislé mutace reprezentují asi 10% mutací p53. Pomocí metody FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast), která se v naší laboratoři využívá k rutinní analýze statutu proteinu p53 v klinických vzorcích, byl vytvořen soubor šesti td mutantů. U všech mutantů jsme určili míru teplotní závislosti, tj. změnu transaktivačních schopností v přítomnosti p53-responzivního elementu RGC v závislosti na různých inkubačních teplotách (25°C, 30°C, 35°C). Pomocí metody „sekvenčně specifické“ FASAY jsme analyzovali diskriminativní charakter jednotlivých mutantů, tj. schopnost nevyváženě transaktivovat různé p53-regulované geny. Dále jsme se pokusili reaktivovat funkci td mutantů p53 prostřednictvím amifostinu, který je v současné době považován za „nadějného kandidáta“ v oblasti reaktivace funkce mutovaného proteinu p53. Pro potvrzení výsledků analýz získaných metodou FASAY, která využívá kvasinkových expresních systémů, jsme připravili vektory p53-pT-REx-DEST30, které budou sloužit pro přenos sekvencí td mutantů do lidských buněk a umožní tak další analýzy td mutantů p53. Výsledky provedených analýz potvrzují výrazný heterogenní charakter funkčních vlastností td mutantů p53. Jednotliví td mutanti se vzájemně lišili především v míře teplotní závislosti. Také diskriminativní charakter, který většina mutantů vykazovala, byl výrazně ovlivněn inkubační teplotou. V přítomnosti amifostinu jsme částečnou obnovu transaktivačních schopností zaznamenali u většiny (5/6) td mutantů.

Abstract:

The p53 protein is a tumor suppressor which plays an important role in maintaining of the genome integrity. p53 is stabilized and activated in response to cell stress and is able to promote cell cycle arrest or programmed cell death. The p53 gene is mutated in about 50% of human cancers. The main proportion of these mutations occurres in DNA-binding domain. As a consequence of the presence of p53 gene point mutations, a mutated form of the p53 protein can develope in the cell. Different mutated forms of the p53 protein have different general transactivation abilities. It depends first of all on the type of mutation. The main purpose of this study was to analyze functional properties of temperature-dependent mutants of tumor suppressor p53. Temperature-dependent mutations represent approximately 10% of all p53 mutations. Using the method FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast), which is used in our laboratory for routine analysis of p53 status in the clinical samples, it was collected a set of 6 temperature-dependent p53 mutants. We analyzed temperature dependency of these mutants, it means the change of transactivation capability in the presence of p53-responsive element RGC depending on different incubation temperatures (25°C, 30°C, 35°C). Using the method „sequence specific“ FASAY we analyzed discriminative character of these mutants, it means the ability of unequal transactivation of different p53-downregulated genes. Next, we tried to reactivate the function of p53 mutants through the use of amifostine. Amifostine is considered to be a goog candidate for reactivation of the p53 mutant function. To confirm our results which were achieved in the yeast expresion system, we prepared expression vectors p53-pT-REx-DEST30, which will be used for the transfer of the p53 mutant’s sequence to the human cells and enable us to continue with other analysis of temperature-dependent p53 mutants. The results of our analysis confirm strong heterogenity of functional properties of p53 mutants. The temperature dependency of our mutants was very individual. The discriminative character was affected by incubation temperature. The presence of amifostine caused recovery of transactivation capabilities in the majority (5/6) of our td p53 mutants.

Keywords

nádorový supresor p53, teplotně závislí mutanti, diskriminativní mutanti, FASAY, transaktivační schopnosti

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2011
• Supervisor: prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry