Typizace amyloidních depozit pomocí hmotnostní spektrometrie ve vzorcích aspirátu tukové tkáně

Bc. Anna BARTÁKOVÁ

Master's thesis

Subtyping of the amyloid deposits by mass spektrometry in subcutaneous fat aspirate specimens

Abstract:

Teoretická část předkládané diplomové práce pojednává o amyloidóze, vzácném onemocnění, charakterizovaném ukládáním patologických proteinů ve tkáních ve formě amyloidu, které vede k poškození a selhání orgánů. Dále poskytuje přehled o různých typech amyloidózy, laboratorních metodách průkazu amyloidu a jeho typizaci. Pro adekvátní léčbu je zapotřebí určit typ abundantního amyloidního fibrilárního proteinu tvořícího amyloidní depozita, nejčastěji pomocí imunohistochemie, nebo proteomické analýzy. Pro účely průkazu a typizace amyloidu se odebírají vzorky z postižených orgánů, jejichž tkáňové řezy se fixují formalínem a zalévají parafínem (FFPE), nebo z břišní tukové tkáně, která obsahuje depozita systémového amyloidu. Pokud jsou vzorky odebírány z tukové tkáně, je pacientům před aspirací tkáně injekčně aplikováno lokální anestetikum mesocain. Nicméně toto léčivo kontaminuje vzorek a při proteomické analýze způsobuje pokles intenzity peptidových signálů v čase své eluce. Experimentální část této práce se zaměřuje na hledání vhodného protokolu pro zpracování proteomických vzorků tukové tkáně, který by odstranil externí kontaminaci mesocainem. Za tímto účelem byly testovány čtyři protokoly: "in StageTip" protokol - protokol pro štěpení proteinů ve špičce (iST), protokol s proteinovou precipitací acetonem s následným zpracováním pomocí iST protokolu (A-iST), "single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation" protokol - protokol pro štěpení proteinů na paramagnetických kuličkách (SP3) a "filter-aided sample preparation" protokol - protokol pro štěpení proteinů na filtru (FASP) na modelových vzorcích plasmy s klesajícím množstvím mesocainu. Všechny testované protokoly vykazovaly srovnatelné a reprodukovatelné výsledky pro pět sledovaných parametrů: procentuální peptidový výtěžek, počet identifikovaných proteinů a peptidů, průměrné sekvenční pokrytí proteinů a relativní distribuce peptidů s vynechanými štěpnými místy po enzymovém štěpení. Nicméně žádný z testovaných protokolů nezajistil úplné odstranění mesocainu ze vzorku.

Abstract:

The theoretical part of this diploma thesis deals with amyloidosis, a rare disease characterized by the deposition of pathological proteins in tissues in the form of amyloid, which leads to organ damage and failure. It also provides an overview of the different types of amyloidosis, laboratory methods of amyloid detection, and its subtyping. For adequate treatment, the type of abundant amyloid fibril protein forming amyloid deposits needs to be determined, mainly by immunohistochemistry or proteomic analysis. The samples for analysis are taken from affected organs, tissue sections of which are fixed with formalin and embedded in paraffin (FFPE), or from abdominal fat tissue containing systemic amyloid deposits. If the samples are collected from adipose tissue, patients are injected with the local anesthetic mesocain before the tissue aspiration. However, this drug contaminates the sample and causes a decrease in peptide signal intensity at the time of its elution during proteomic analysis. The experimental part of this thesis focuses on the search for a suitable protocol for the processing of proteomic adipose tissue samples that would remove external contamination by mesocain. For this purpose, four protocols were tested: "in StageTip" protocol - a protocol for protein cleavage at the tip (iST), acetone protein precipitation protocol followed by iST protocol (A-iST), "single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation" protocol - a protocol for protein cleavage on paramagnetic beads (SP3) and "filter-aided sample preparation" protocol - a protocol for protein cleavage on a filter (FASP) on model plasma samples with decreasing amounts of mesocaine. All the tested protocols showed comparable and reproducible results for the five investigated parameters: percentage of peptides recovered, number of identified proteins and peptides, average sequence coverage of proteins and relative distribution of peptides with missed cleavage sites after enzymatic cleavage. However, no protocol was found in this thesis to ensure the complete removal of mesocain from the sample.

Keywords

Amyloidóza, tuková tkáň, mesocain, proteomika

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dušan Holub, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry