Molekulární znaky v diagnostice Barrettova jícnu

Mgr. Pavla LUŽNÁ

Doctoral thesis

Molecular markers in Barrett´s esophagus diagnostics

Abstract:

Barrettův jícen (BJ) je onemocnění zažívacího traktu, jehož vznik a průběh je významně ovlivněn životním stylem. Přestože většina pacientů s touto chorobou žije desetiletí relativně bez komplikací, u 0,5-1 % z nich je každý rok diagnostikován ezofageální adenokarcinom. Prevalence ezofageálního karcinomu,(který může být ovšem diagnostikován taktéž u zcela bezpříznakového pacienta) není nijak dramaticky vysoká. O to závažnější je skutečnost, že počet pacientů s adenokarcinomem v euroatlantické populaci stoupá, zatímco efektivní terapie neexistuje a léčba pacientů zůstává pouze paliativní. Současná medicína zná terapeutické zásahy, které dokáží u prekancerózních stádií onemocnění eliminovat riziko další transformace, ovšem jejich indikace musí být ze zdravotních i ekonomických důvodů řádně opodstatněná. Proto je velmi důležité umět vyhledat mezi pacienty rizikové jedince, pro které je podstoupení této terapeutické intervence žádoucí. S příchodem pokročilých technik molekulární biologie do medicíny započala nová éra v diagnostice chorob. Snahou molekulárních biologů je vždy genetický, epigenetický a proteomický popis těchto onemocnění, které vedou k pochopení jeho podstaty. Některé choroby jsou již poměrně detailně popsány, u jiných popis a zejména vysvětlení podstaty zatím chybí. Proces karcinogeneze je spojen s poškozením genetické výbavy buněk, což má za následek ztrátu schopnosti korigovat proliferační aktivitu. Jedním z iniciačních kroků tohoto jevu je dlouhodobé působení zánětlivých podnětů. Organizmus dokáže těmto vlivům odolávat často i desítky let a záleží na přidružených rizikových faktorech, zda tento stres dokáže kompenzovat. Před 20 lety došlo k převratnému objevu nových regulátorů genové exprese - mikroRNA. Jejich potenciál regulovat až 30 % genů znamená, že jejich role je neopomenutelná v řadě biologických procesů souvisejících s vývojem, diferenciací,nebo programovanou buněčnou smrtí, přičemž deregulace těchto dějů má spojitost se zánikem organizmu nebo naopak se ztrátou kontroly nad udržením integrity vlastního genomu. Cílem této dizertační práce proto bylo nahlédnout do popisu vybraných proteinů zánětlivé dráhy (IL-1beta; IL-8), která je známým iniciačním krokem transformace epitelu jícnu, zjistit míru odpovědi na poškození DNA (detekce fosforylovaného histonu H2AX na pozici Ser139), které je tímto zánětem vyvoláno a popsat, jak se vlivem těchto změn mění exprese defosforylovaného (aktivního) beta-kateninu, který je klíčovou molekulou soudržnosti epiteliálních buněk. MikroRNA jsou molekuly, které mohou výhledově sloužit jako biomarkery vlastního vzniku a progrese mnoha onemocnění. Těchto molekul jsou stovky, proto byly na základě literatury vyselektovány čtyři kandidátní (miR-21, miR-192, miR-196a a miR-203), které byly dále detailněji studovány, přičemž byl kladen důraz na co nejvhodnější interpretaci výsledků pomocí správně zvolených endogenních kontrol. V obou studiích bylo využito relativně snadné dostupnosti archivních bioptických vzorků zalitých do parafínu, jejichž počet umožnil také validaci získaných dat. Při studiu mikroRNA expresních profilů byla tkáň navíc mikrodisekována, čímž byla získána pouze čistá transformovaná buněčná populace, což znamená eliminaci rizika kontaminace vzorku okolní netransformovanou tkání. Dosažené výsledky vypovídají o tom, že k akumulaci odpovědi na poškození DNA dochází až v pozdním stádiu transformace epitelu, zatímco exprese jednoho ze zánětlivých cytokinů je v průběhu onemocnění kontinuální. U tří ze čtyř studovaných mikroRNA dochází jednoznačně ke změně exprese v transformované tkáni ve srovnání s kontrolou a

Abstract:

exprese mikroRNA-196a koreluje také s progresí onemocnění.

Abstract:

Barrett´s esophagus (BJ) is the disease of the gastrointestinal tract, whose origin and development is importantly influenced by the lifestyle and in 0,5?1 % of patients there is diagnosed esophageal adenocarcinoma every year. The number of patients with esophageal adenocarcinoma in the Euroatlantic population is raising, effective therapy does not exist and the treatment remains only paliative. Current medicine knows therapeutical interventions but it is very important to know how to find the ?hazardous? individuals among patients, for whom the therapeutic intervention undergoing is desirable.The process of carcinogenesis is connected with the destruction of the genetic equipment of cells, which leads to the loss of the ability to control the proliferative activity. One of the initiation steps of this phenomenon are long-term inflammation inducements operating. The organism is able to resist to these influences decades very often and it depends on the associated risk factors, if the organism is able to compensate that stress. 20 years ago there an epoch-making event happened ? new gene expression regulators ? microRNAs were discovered. Their potential to regulate till 30 % of genes means that their role is inalienable in many biological processes. That is why the aim of this dissertation thesis was to look to the description of selected proteins of the inflammatory signaling pathway (IL-1?; IL-8), which is known to be the initial step of the esophageal epithelium transformation, to investigate the rate of answer to the DNA damage response (detection of histone H2AX phosphorylated at the Ser139 position), which is evoked by this inflammation and to describe how the expression of dephosphorylated (active) ?-catenine, which is the crucial molecule of the epithelial cells cohesion, changes. MicroRNAs are molecules which can in the future serve as biomarkers of origin and progression of many diseases. There are hundreds of these molecules, therefore on the literary basis there were selected four candidates (miR-21, miR-192, miR-196a and miR-203), which were studied in detail, and there was a emphasis to interprete the results with correctly selected endogenous controls. In both of the studies we used the relatively easily available FFPE bioptic samples, and their number enabled validation of the data obtained as well. In addition, in the microRNA study the tissue was microdissected, thereby only the ?pure? population of the transformed cells was acquired and that means the elimination of contamination risk of the sample by the surrounding non-transformed tissue. The results achieved testify, that the accumulation of the DNA damage response comes until the later stage of the epithelial transformation, whereas the expression of one of the inflammatory cytokines is continual through the disease stages. Expression of three microRNAs out of four is conclusively deregulated in the transformed tissue compared to control and microRNA-196a expression correlates with the disease progression as well.

Keywords

Barrettův jícen, mikroRNA, real-time PCR, imunohistochemie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2013

Accessible from:: 13. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 26. 6. 2013

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Anatomy, Histology and Embryology / Anatomy, Histology and Embryology