Identifikace a funkční analýza prognostických mikroRNA u pacientů s karcinomem pankreatu

Bc. Soňa Klusová

Master's thesis

Identification and functional analysis of prognostic microRNAs in pancreatic cancer

Abstract:

Východisko: Nádory slinivky břišní jsou jednou z nejčastějších příčin úmrtí na onkologická onemocnění. Důvodem je dlouhá asymptomatická fáze a velmi agresivní průběh. Proto je většina pacientů diagnostikována v metastatickém stádiu a incidence tohoto onemocnění je téměř shodná s mortalitou. Chronická pankreatitida je další závažné onemocnění slinivky břišní způsobené přítomností zánětlivých elementů, které zapříčiňují destrukci vnější části žlázy. Mezi klíčové regulátory v buňce patří mikroRNA, které regulují genovou expresi na post-transkripční úrovni. Tyto krátké nekódující RNA můžou plnit funkci jak onkogenu, tak nádorového supresoru a jejich deregulace může přispívat ke vzniku závažných onemocnění. Cíl práce: Cílem této diplomové práce bylo identifikovat mikroRNA s prognostickým potenciálem, které hrají důležitou roli v patogenezi nádorů slinivky břišní, a následně tyto mikroRNA funkčně charakterizovat pomocí in vitro analýz. Dílčím cílem práce bylo analyzovat schopnost jednotlivých mikroRNA odlišit chronickou pankreatitidu od duktálního adenokarcinomu pankreatu. Metody: Exprese vybraných mikroRNA (miR-21, miR-34a, miR-198, miR-217) byla analyzována pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. MiR-21 a miR-217 byly následně charakterizovány s využitím in vitro analýz (MTT test, počítání buněk, Scratch-wound assay, analýza buněčného cyklu a apoptózy) na stabilních buněčných liniích BxPC-3 a PANC-1 odvozených od duktálního adenokarcinomu pankreatu. Nakonec bylo provedeno celogenomové profilování exprese krátkých RNA pomocí miRNA GeneChip 3.0 Affymetrix arrays. Výsledky: V této práci byla potvrzena rozdílná exprese čtyř miRNA (miR-21, miR-34a, miR-198, miR-217) mezi zánětlivou tkání a tkání adenokarcinomu pankreatu. Dále bylo zjištěno, že miR-21 a miR-198 významně korelují s prognózou pacientů s nádorem pankreatu (celkové bezpříznakové přežití: P < 0,0001; celkové přežití: P = 0,0015). Výsledky in vitro analýz na buněčných liniích prokázaly, že utlumení hladiny miR-21 způsobilo snížení metabolické aktivity buněk PANC-1 po 96 hodinách od transfekce (P = 0,0464) a navýšení miR-217 vyvolalo pokles rychlosti proliferace buněk PANC-1 také 96 hodin po transfekci (P = 0,0218). Výsledky analýz neprokázaly žádny vliv miR-21 a miR-217 na migraci buněk. Co se týče regulace buněčného cyklu, navýšení hladiny miR-217 způsobilo zástavu v G1 fázi u buněk PANC-1 (P = 0,0341). Studium apoptózy neprokázalo žádný významný vliv transfekce pre-miR-217 na zastoupení buněk v jednotlivých fázích apoptózy. S využitím technologie miRNA GeneChip 3.0 Affymetrix Arrays byl identifikován panel 15 miRNA (P < 0,00001), 5 pre-miRNA (P < 0,0001) a 22 snoRNA (P < 0,001) s prognostickými vlastnostmi. Závěr: Na základě výsledků této studie se zdá, že miR-21, miR-34a, miR-198 a miR-217 by mohly sloužit jako nové biomarkery pro odlišení chronické pankreatitidy od duktálního adenokarcinomu pankreatu. Zvýšená exprese miR-21 a miR-198 byla asociována s kratší dobou do progrese onemocnění a s celkově kratším přežíváním onkologických pacientů, tyto dvě mikroRNA by tudíž mohly sloužit jako nové prognostické biomarkery. Pomocí celogenomového profilování krátkých RNA bylo dále identifikováno několik potenciálních prognostických molekul, na základě jejichž exprese bylo možné odlišit pacienty s lepší celkovou prognózou od pacientů s prognózou horší. Tyto výsledky bude nezbytné dále validovat pomocí kvantitativní PCR v reálném čase.

Abstract:

Background: Pancreatic cancer is one of the leading causes of cancer-related death. It is a result of late clinical presentation and very aggressive course of the disease. Thus, most patients are diagnosed with metastases in late stages and incidence is almost identical with mortality. Chronic pancreatitis is another severe disease of pancreas caused by inflammatory elements leading to the destruction of the outer part of the gland. MicroRNAs are essential post-transcriptional regulators of gene expression. These small non-coding RNAs can function as both, oncogenes or tumor suppressors, and their deregulation can lead to severe diseases. Purpose: The aim of this thesis was to identify microRNAs with the prognostic potential involved in the pathogenesis of pancreas and their functional in vitro characterization on cancer cell lines. The study was also focused on analysis of microRNAs´ potential to differentiate chronic pancreatitis from pancreatic ductal adenocarcinoma. Methods: The expression levels of four microRNAs (miR-21, miR-34a, miR-198, miR-217) was assessed using quantitative real-time PCR. MiR-21 and miR-217 were selected for functional in vitro analysis (MTT assay, counting cells, scratch-wound assay, analysis of cell cycle and apoptosis) on the cell lines BxPC-3 and PANC-1 derived from pancreatic ductal adenocarcinoma. Finally, whole-genome expression profiling of short RNAs was carried out using miRNA GeneChip 3.0 Affymetrix arrays. Results: In this study, different expression of four miRNAs (miR-21, miR-34a, miR-198, miR-217) in chronic pancreatitis and ductal adenocarcinoma tissue was confirmed. Moreover, miR-21 and miR-198 significantly correlated with the prognosis of patients with pancreatic cancer (disease-free survival: P < 0,0001; overall survival: P = 0,0015). Results of in vitro analysis showed that down-regulated expression of miR-21 caused reduction of the metabolic activity of PANC-1 cells 96 hours after transfection (P = 0,0464) and up-regulated expression of miR-217 caused decreased rate of cell division 96 hours after transfection (P = 0,0218). The migration of the cells was not changed after the transfection of anti-miR-21 and pre-miR-217. Concerning the cell cycle regulation, increased level of miR-217 caused arrest of PANC-1 cells in G1 phase (P = 0,0341). The effect of miR-217 on apoptosis was not detected. Using miRNA GeneChip 3.0 Affymetrix Arrays, a set of 15 microRNAs (P < 0,00001), 5 pre-microRNAs (P < 0,0001) and 22 snoRNAs (P < 0,001) with prognostic properties was identified. Conclusion: Based on the obtained results, it seems that miR-21, miR-34a, miR-198 and miR-217 may serve as new biomarkers for differentiation of chronic pancreatitis from pancreatic ductal adenocarcinoma. Increased expression of miR-21 and miR-198 was associated with shorter disease-free survival and overall-survival of oncologic patients, thus they should serve as new prognostic biomarkers. Using whole-genome expression profiling of small RNAs, prognostic molecules with potential to differentiate patients with good and poor prognosis were identified. Further validation of these results using quantitative real-time PCR will be necessary.

Keywords

duktální adenokarcinom pankreatu, chronická pankreatitida, mikroRNA, prognostické biomarkery, pancreatic ductal adenocarcinoma, chronic pancreatitis, microRNA, prognostic biomarkers

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry