Zavedení kvantitativních proteomických metod pro studium Wnt signalizace

Bc. Miroslav Hutňan

Master's thesis

Implementation of quantiative proteomics into the analysis of Wnt signaling

Abstract:

Response mediated by a signaling pathway is a complex process, of which dynamic nature and ceaseless modulation of the response makes understanding of the basic signal transmission principles challenging. Specific antibody based methods in many cases offer a satisfactory answer to a question asked, however, to obtain a bigger picture about pathway functioning and to identify all its interacting parts is this approach insufficient. Recently, mass spectrometry based methods are being increasingly used to analyze relative and absolute quantities of selected proteins, their interactions and modifications, all on a proteome-wide level. This work was centered on Wnt signaling pathway, which plays an important role in embryonal development and homeostasis maintenance in animals and its defects are known to be involved in development of oncologic diseases. Mass spectrometry methods SRM and SWATH were used to inspect the amount of Dishevelled protein isoforms in cell lysates and using TMT labelling method, proteome wide changes in expression upon Wnt pathway activation and Dishevelled proteins exclusion from signaling were analyzed.

Abstract:

Odpověď zprostředkovaná signální dráhou je komplexním procesem, jehož dynamická povaha a neustálá modulace odpovědi ztěžuje pochopení základních principů přenosu signálu. Metody založené na specifických protilátkách poskytují v mnoha případech uspokojující odpověď na řešenou otázku, ale pro získání celkového obrazu o fungování dráhy a identifikaci všech interagujících součástí je tento přístup nedostačující. V posledních letech se do popředí dostávají přístupy hmotnostní spektrometrie umožňující sledování absolutních a relativních množství vybraných proteinů, jejich interakce a modifikace, a to na celoproteomové úrovni. Tato práce se zaměřila na signální dráhu Wnt, která u živočichů hraje zásadní roli v embryonálním vývoji a udržení homeostázy a její poruchy v mnoha případech vedou k rozvoji onkologických onemocnění. Metodami hmotnostní spektrometrie SRM a SWATH bylo zkoumáno množství izoforem proteinu Dishevelled v buněčných lyzátech a s použitím TMT značení sledované celoproteómové změny při aktivaci dráhy Wnt a při vyřazení proteinů Dishevelled ze signálování.

Keywords

Wnt signalizace, Dishevelled, HEK293, hmotnostní spektrometrie, absolutní kvantifikace, SRM, SWATH, TMT Wnt signaling, mass spectrometry, absolute quantification, TMT

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 1. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 8. 2. 2017
• Supervisor: prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics