Modulace apoptózy indukované TRAILem u nádorových buněk tlustého střeva prostřednictvím chemoterapeutických látek

Mgr. Iva Jelínková, Ph.D.

Doctoral thesis

Modulation of TRAIL-induced apoptosis by chemotherapeutic drugs in colon cancer cells

Abstract:

Platinové komplexy, mezi které patří i cisplatina, se používají v léčbě řady solidních nádorů. Jejich aplikace v terapii je však často omezena vnitřní nebo získanou rezistencí a doprovázena závažnými nežádoucími účinky. Proto jsou vyvíjeny nové platinové analogy s cílem překonat rezistenci a snížit vedlejší efekty. Jedním z takových komplexů je nový platinový derivát LA-12, s atomem platiny v oxidačním čísle (IV), který je účinným v in vitro i in vivo testech u mnoha typů nádorů, včetně rezistentních k cisplatině. Cytokin TRAIL (ligand indukující smrt, patřící do rodiny faktoru nekrotizujícího nádory) je známý pro svoji schopnost indukovat apoptózu u mnoha typů nádorových buněk bez ovlivnění buněk normálních. TRAIL, který působí jako ligand, aktivuje apoptózu po vazbě k receptorům smrti. U buněk typu II, které vyžadují amplifikaci apoptotického signálu přes mitochondrie, hrají důležitou roli proteiny Bcl-2 rodiny. V průběhu mitochondriální dráhy dochází k aktivaci proapoptotických proteinů Bak a Bax, které indukují propustnost vnější mitochondriální membrány, mající za následek uvolnění cytochromu c a následnou aktivaci kaspázy-9. Rozhodnutí buňky podstoupit apoptózu může být ovlivněno poměrem a vzájemnou interakcí mezi pro- a anti-apoptotickými členy rodiny Bcl-2. Mnoho typů nádorů je ale bohužel k působení cytokinu TRAIL rezistentní. Právě proto se dnes TRAIL testuje v kombinaci s chemoterapeutickými látkami ve snaze zcitlivět nádorové buňky k jeho působení. Jako první jsme pozorovali, že subtoxické dávky LA-12 i cisplatiny posílily apoptózu indukovanou TRAILem u nádorových buněk kolonu a prostaty. Z tohoto důvodu jsme se zaměřili na studium molekulárních mechanismů zodpovědných za tento efekt a srovnali ho s cisplatinou. Oba zmiňované platinové deriváty zvýšily expresi DR5 na povrchu buněk, akumulaci receptorů smrti v lipidových raftech a urychlily internalizaci TRAILu. Současně jsme potvrdili významnou funkční úlohu DR5 v kombinovaném cytotoxickém působení platinových a cytokinu TRAIL. Popsali jsme rovněž, že mitochondrie hrají nezbytnou úlohu v cytotoxickém působení LA-12/cisplatiny a TRAILu u nádorových buněk kolonu. Stimulace mitochondriální apoptotické dráhy byla spojena se zvýšenou expresí a/nebo aktivací proteinů Bax a Bak, poklesem mitochondriálního membránového potenciálu a aktivací kaspázy-9. Na rozdíl od cisplatiny komplex LA-12 významně zvýšil expresi některých proapoptotických proteinů rodiny Bcl-2 (Noxa a Bim). S využitím buněk deficientních pro Bax jsme prokázali úlohu mitochondrií při posílení apoptózy indukované TRAILem prostřednictvím LA-12. Ukázali jsme, že LA-12 významně zvýšila množství proteinu c-Myc, jehož důležitá funkční role při aktivaci mitochondrií a apoptóze po působení LA-12 a TRAIL byla následně prokázána. Současně jsme účinek kombinace LA-12 a TRAILu prokázali i u buněk odvozených z různých stádií vývoje nádorů tlustého střeva, nezávisle na proteinu p53. Naopak podání této kombinace u epiteliálních buněk odvozených z normální tkáně tlustého střeva neindukovalo žádné toxické účinky. Naše výsledky prokázaly, že platinový derivát LA-12 je schopný modulovat jak receptorovou, tak mitochondriální apoptotickou signalizaci indukovanou TRAILem. LA-12 vykazovala ve srovnání s cisplatinou lepší schopnost zcitlivět buňky, posílit mitochondriální apoptotickou dráhu a zvýšit množství některých pro-apoptotických molekul. Uvedenéyto vlastnosti dělají z platinového derivátu LA-12 zajímavého a slibného kandidáta vhodného pro kombinovanou protinádorovou terapii.

Abstract:

Platinum-based drugs such as cisplatin are used in the therapy of many solid cancers, but their application is limited due to acquired or inherited resistance and serious side effects. To overcome the toxicity and resistance to cisplatin, numerous analogues of platinum were developed. Recently, platinum (IV) adamantylamine ligand-containing complex LA-12 has been introduced and shown as highly effective in many cancer cells including the cisplatin resistant, both in vitro and in vivo. TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) is a promising cytokine known for its ability to induce apoptosis selectively in many cancer cell types but not normal cells. TRAIL kills cancer cells by binding specific cell surface death receptors (DRs) and triggering apoptotic machinery. In certain cells (type II), DR-mediated apoptotic signalling requires amplification via mitochondria. In this pathway, pro-apoptotic Bcl-2 family members (Bax and Bak) induce permeability of the mitochondrial outer membrane, which regulates the release of cytochrome c and caspase-9 activation. The cell's decision to undergo apoptosis is also determined by balance and interactions between the others members of Bcl-2 protein family. However, in a number of tumors, the successful application of TRAIL can be hampered due to their resistance caused by defects at different levels of apoptosis signalling pathways, including death receptors or mitochondria. Therefore, it is crucial to find new approaches, e.g. combined treatments with anticancer drugs, to be able to overcome these obstacles. We were the first who showed that subtoxic doses of LA-12 and cisplatin are very effective in potentiation of TRAIL-induced apoptosis in human colon and prostate cancer cells, further investigated the molecular mechanisms involved, and compared them with the action of cisplatin. We showed that both platinum complexes increased the cell surface expression of DR5, accumulation of DRs in lipid rafts and acceleration of TRAIL internalization. The important role of DR5 in apoptosis induced by the combination of platinum drugs and TRAIL was also confirmed. We further demonstrated that mitochondria are essentially involved in killing effects exerted by the combination of LA-12/cisplatin and TRAIL in colon cancer cells. Stimulation of mitochondrial pathway was associated with increased expression and/or activation of Bax and Bak protein, drop of mitochondrial membrane potential and caspase-9 activation. In contrast to cisplatin, we also observed that LA-12 was promising inductor of selected BH3-only proteins (Noxa and Bim). Using Bax-deficient cells, we demonstrated an important role of mitochondria in LA-12-mediated potentiation of TRAIL-induced apoptosis. LA-12 significantly upregulated the level of c-Myc that was consequently characterized as important molecule in mitochondrial activation and apoptosis in colon cancer cells treated with LA-12 and TRAIL. The combined action of LA-12 and TRAIL was also successfully confirmed in cells derived from different stages of colon cancer development, independently on p53 status. On the other hand, the application of LA-12 in combination with TRAIL did not exert any significant cytotoxic effects in normal human colon epithelial cells. Taken together, our data demonstrated promising efficiency of LA-12 in modulation both receptor and mitochondrial TRAIL-induced apoptotic pathway. Interestingly, compared to cisplatin, LA-12 exhibited higher sensitizing effects and the ability to trigger mitochondrial pathway and the upregulation of several proapoptotic molecules. These properties make LA-12 interesting candidate for combination anticancer therapy.

Keywords

Platinová cytostatika, LA-12, TRAIL, apoptóza, nádor kolonu Platinum drugs, apoptosis, colon cancer

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 10. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 31. 10. 2014
• Supervisor: RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D.
• Reader: RNDr. Jana Nekvindová, Ph.D., prof. Ing. Jiří Neužil, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology