Pěstování a uplatnění léčebného konopí (Cannabis sativa L.)

Ing. Anežka Janatová

Disertační práce

Growing and use of medical cannabis (Cannabis sativa L.)

Anotace:

Téměř po sto letech stojíme u světové renesance léčby konopím. Používání konopí s vyšším obsahem delta-9-tetrahydrokanabinolu, než je 0,3 %, bylo ve většině států světa dlouhou dobu kriminalizováno. V posledních letech se tato situace začala rapidně měnit a v mnoha státech bylo legalizováno konopí pro léčebné použití a v některých dokonce i konopí pro užívání rekreační. Česká zemědělská univerzita v Praze byla první institucí v České Republice, které bylo Ministerstvem zdravotnictví ČR povoleno v rámci výzkumu pěstování konopí s vyšším obsahem delta-9-tetrahydrokanabinolu, než je 0,3 %, také nazývané: „Léčebné konopí“. V kultivační místnosti bylo po šest pěstebních cyklů v řízených podmínkách kultivováno sedm různých genotypů: Conspiracy Kush, Jilly Bean, Jack Cleaner 2, Jack Skellington, Nordle, Nurse Jackie a National Helath Service, u nichž byly sledovány výnosy a stabilita obsahu delta-9-tetrahydrokanabinolu a kanabidiolu. Sušené květenství rostlin bylo použito zejména pro výrobu ethanolových extraktů, u nichž byla sledována výtěžnost, obsah hlavních kanabinoidů a relativní obsah látek terpenické povahy. Extrakty byly dále použity pro in vitro studie cytotoxicity na buněčných liniích kolorektálního adenokarcinomu a hepatokarcinomu. Průměrný výnos sušeného květenství byl 21,02 ± 3,33 g/rostlinu a mezi jednotlivými genotypy nebyly ve výnosech zjištěny průkazné rozdíly. Průměrný obsah delta-9-tetrahydrokanabinolu se pohyboval v rozmezí od 15,9 ± 2,04 % do 20,77 ± 1,62 % a průměrný obsah kanabidiolu v rozmezí od 0,45 ± 0,06 % do 0,6 ± 0,06 %. U všech vybraných genotypů byl obsah hlavních kanabinoidů po šest pěstebních cyklů kromě třetího relativně stabilní. Genotypy Conspiracy Kush, Jilly Bean, Jack Cleaner 2, Jack Skellington a Nurse Jackie odpovídají obsahem hlavních kanabinoidů požadavkům české legislativy i aktuálním požadavkům Státního ústavu pro kontrolu léčiv.Průměrná výtěžnost ethanolových extraktů byla 20,77 ± 6,06 % a mezi jednotlivými genotypy nebyly ve výnosech zjištěny průkazné rozdíly. Průměrný obsah delta-9-tetrahydrokanabinolu v extraktech byl 59,1 ± 2,43 % a kanabidiolu 1,84 ± 0,17 %. Statisticky prokazatelně byl nejvyšší obsah obou kanabinoidů naměřen v extraktu z genotypu Nurse Jackie. V extraktech vybraných genotypů bylo dále identifikováno více než 60 různých látek terpenické povahy, což by mohlo pomoci k objasnění vzájemné synergie některých látek při následném testování biologické aktivity konopných extraktů. Majoritní monoterpeny a seskviterpenoidy které byly detekovány u většiny genotypů, jsou: limonen, linalol, fenchol,cis-pinokarveol, α-terpineol, β-karyofylen, trans-α-bergamoten, α-humulen, γ-kurkumen, selina-3,7(11)-dien, karyofylen oxid, guaiol, γ-eudesmol, β-eudesmol, α-bisabolol a další. Extrakty všech genotypů vykazovaly nejvyšší pozitivně selektivní cytotoxicitu proti buňkám kolorektálního karcinomu Ht-29 (SI = 0,49 ± 0,12). Minimální inhibiční koncentrace (IC50) extraktů pro Ht-29 se pohybovaly v rozmezí od 8,48 ± 2,4 % do 25,7 ± 2,39 %, kdy extrakt z genotypu Jilly Bean se jevil jako nejméně cytotoxický. Pro IC50 Ht-29 i porovnávaných zdravých buněk FHs 74 Int, bylo zapotřebí 2× vyšší koncentrace extraktu než ostatních. U buněčných linií kolorektálního karcinomu Caco-2 působily selektivně cytotoxicky extrakty z genotypů Jilly Bean (SI 0,44) a Nordle (SI 0,59) a u linií hepatokarcinomu Hep-G2 jednoznačně selektivně na tyto buňky působil extrakt z genotypu Jilly Bean (SI 0,62). Pouze u těchto dvou genotypů byl detekován β-selinen, kterého měl genotyp Jilly Bean mnohonásobně vyšší obsah než Nordle. Lze se domnívat, že přít

Anotace:

omnost tohoto seskviterpenu by mohla mít vliv na výslednou pozitivně selektivní cytotoxicitu u rakovinných buněk tlustého střeva Caco-2 a rakovinných buněk jater Hep-G2. V poslední době je ve výzkumu léčebného konopí věnována velká pozornost konopným extraktům a takzvanému „Entourage Effect,“ neboli léčebným účinkům komplexního spektra účinných látek. Z mnoha studií je známo, že některé látky mohou zvyšovat ale také snižovat nebo zcela blokovat biologickou aktivitu dalších účinných látek v rostlině, či v jejím výtažku. Vzhledem k tomu, že v konopí bylo identifikováno více než 1200 různých látek, na světě je vyšlechtěno více než 700 různých chemovarů, nemluvě o počtu diagnóz či jejich odlišných stádií a individuálnímu metabolismu každého pacienta, čeká výzkum léčby konopím ještě dlouhá cesta. Tato studie přispěla k rozšíření seznamu popsaných genotypů konopí vhodných pro léčebné použití, které mají stabilní obsah kanabinoidů a u některých z genotypů byly potvrzeny cytotoxické účinky na buněčných liniích vybraných lidských karcinomů.

Abstract:

After almost one hundred years of cannabis prohibition, we now observe the worldwide renaissance of the use of cannabis for medical purposes. The use of cannabis with a delta-9-tetrahydrocannabinol content higher than 0.3 % has been criminalized for a long time in most countries in the world. Over the past few years, the situation has changed rapidly, cannabis has been legalized for medical use in many countries and in some countries even for recreational use. Czech University of Life Sciences Prague was the first institution in the Czech Republic approved by the Ministry of Health of the Czech Republic in the research of cultivation of cannabis with delta-9-tetrahydrocannabinol content higher than 0.3 %, so-called „Medical Cannabis”. Seven different genotypes (Conspiracy Kush, Jilly Bean, Jack Cleaner 2, Jack Skellington, Nordle, Nurse Jackie, and National Helath Service) were cultivated in the grow-room under controlled conditions for six growing cycles, which were monitored for yield and stability of delta-9-tetrahydrocannabinol and cannabidiol content. Dried inflorescences of plants were used mainly for production of ethanol extracts, which were monitored for yield, content of main cannabinoids and relative content of terpenoids. The extracts were further used for in vitro cytotoxicity studies on colorectal adenocarcinoma and hepatocarcinoma cell lines. The average yield of dried inflorescence was 21.02 ± 3.33 g/plant and there were no significant differences between genotypes. The average delta-9-tetrahydrocannabinol content ranged from 15.9 ± 2.04 % to 20.77 ± 1.62 % and the average cannabidiol content ranged from 0.45 ± 0.06 % to 0.6 ± 0.06 %. In all selected genotypes, the content of major cannabinoids was relatively stable for six growing cycles except the third. The genotypes Conspiracy Kush, Jilly Bean, Jack Cleaner 2, Jack Skellington and Nurse Jackie match the content of the main cannabinoids to the requirements of Czech legislation and the current requirements of National Office for Drug Control. The average yield of ethanolic extracts was 20.77 ± 6.06 % and there were no significant differences between genotypes. The average content of delta-9-tetrahydrocannabinol in extracts was 59.1 ± 2.43 % and cannabidiol 1.84 ± 0.17 %. Statistically, the highest content of main cannabinoids was measured in the Nurse Jackie genotype extract. More than 60 different terpenoids were identified in extracts of selected genotypes, which could help to clarify the synergy of some substances in subsequent testing of the biological activity of cannabis extracts. The major monoterpenes and sesquiterpenes detected in most genotypes are: limonene, linalool,fenchol, cis-pinocarveol, α-terpineol, β-caryophyllene, trans-α-bergamotene, α-humulene, γ-curcumene, selina-3,7(11)-diene, caryophyllene oxide, guaiol, γ-eudesmol, β-eudesmol, α-bisabolol and others. Extracts of all genotypes showed the highest positive selective cytotoxicity against Ht-29 colorectal cancer cells (SI = 0.49 ± 0.12). The minimum inhibitory concentrations (IC50) of the extracts against Ht-29 ranged from 8.48 ± 2.4 % to 25.7 ± 2.39 %. Extract from Jilly Bean was identified as least cytotoxic, 2-fold higher concentration of this extract was necessary to reach IC50 for Ht-29 and FHs 74 Int cells compare to the other extracts. In the Caco-2 colorectal adenocarcinoma cell lines, extracts from the Jilly Bean (SI = 0.44) and Nordle (SI = 0.59) genotypes were selectively cytotoxic. The highest positive selective cytotoxicity in the hepatocarcinoma cell lines Hep-G2 showed uniquely the Jilly Bean (SI = 0.62) genotype. Only in these two genotypes was detected β-selinene, whose genotype Jilly Bean had higher content than Nordle. It is believed that the presence of this sesquiterpene could affect the resulting positive selective cytotoxicity in Caco-2 colon cancer cells and Hep-G2 liver cancer cells. At this time, in research on medical cannabis, attention i

Abstract:

s paid mainly to cannabis extracts and "Entourage Effect," the therapeutically effects of the complex spectrum of biologically active compounds. It is known from many studies that some substances may increase but also reduce or completely block the biological activity of other active substances in the plant or in their extract. With more than 1200 different substances identified in cannabis, more than 700 different chemovars being bred in the world, not to mention the number of diagnoses or their different stages and the individual metabolism of each patient, research into cannabis treatment is still a long way to go. This study extended the list of described cannabis genotypes with stable cannabinoids content and some of the genotypes confirmed cytotoxic effects on selected human cancer cells.

Klíčová slova

léčebné konopí, pěstební cyklus, delta-9-tetrahydrokanabinol, kanabidiol, terpenické látky, plynová chromatografie, ethanolový extrakt, cytotoxicita

Keywords

medical cannabis, growing cycle, delta-9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol, terpenoids, gas chromatography, ethanolic extract, cytotoxicity

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 8. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Pavel Klouček, Ph.D.
• Oponent: Olga Leuner, Ph.D., Ing., Miroslav Habán, Bc., externi, Karel Šmejkal, externi

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Doktorský studijní program / obor:
Fytotechnika / Speciální produkce rostlinná