Funkční analýza mutací zodpovědných za vznik primárních imunodeficiencí

Mgr. Lucie Grodecká, Ph.D.

Doctoral thesis

Functional significance of mutations in the genes associated with primary immunodeficiency development

Abstract:

Úvod Genetické varianty mohou být neškodné i škodlivé, přičemž ty škodlivé často podmiňují závažná lidská onemocnění včetně primárních imunodeficiencí (PID). Rozpoznání škodlivých variant není vždy jednoduchou záležitostí, protože řada z nich neovlivňuje přímo funkční produkt genu (například kódující sekvenci proteinu), ale spíše nepřímo narušuje regulaci exprese. Nejčastějším typem takových „regulačních“ defektů vedoucích k onemocněním člověka jsou poruchy sestřihu pre‑mRNA. I tyto aberace však zůstávají často nerozpoznané, zřejmě proto, že regulátory sestřihu mívají velmi degenerované sekvence vyskytující se po celé délce genu. I v případě, že jsou varianty vedoucí k poruchám sestřihu rozpoznány, posouzení jejich vlivu na finální podobu sestřihu a tedy na funkci produktu genu není triviální. Tato práce zkoumá prevalenci mutací ovlivňujících sestřih pre-mRNA u genů spojených se vznikem PID a u několika dalších genů. Dále prozkoumává možnosti rozpoznání těchto mutací a odhadu jejich vlivu na výslednou podobu sestřihu. V neposlední řadě jsou zde navrženy nové mechanizmy aberantního sestřihu. Metody Pomocí in silico predikčních nástrojů bylo analyzováno celkem 111 různých genových variant. 64 z nich pak bylo zkoumáno pomocí in vitro metod s využitím sestřihové minigenové analýzy a RT‑PCR z RNA pacientů (s ohledem na dostupnost tohoto materiálu). Výsledky Prevalence sestřihových aberací v genech spjatých s rozvojem PID se ukázala být přibližně 22 %. In silico predikční nástroje přinesly spolehlivé výsledky ohledně poruch míst sestřihu, avšak predikce poruch přídatných sestřihových regulačních elementů se projevily jako málo věrohodné. Přesto se i v této druhé kategorii našly tři nástroje, které vykázaly slibnou efektivitu: konkrétně ESRseq, EX-SKIP a Hexplorer. Kromě toho dva nástroje, konkrétně NNSplice a MaxEnt, ukázaly jistou schopnost rozlišit kryptická místa sestřihu aktivovaná po poruše autentických míst od těch inaktivních. Dále byly určeny specifické hraniční hodnoty, které pomáhají rozlišit varianty v první pozici exonu ovlivňující sestřih od variant tichých. Srovnání minigenové analýzy a RT-PCR z RNA pacientů ukázalo vysokou míru spolehlivosti minigenové analýzy v určování, zda určitá varianta ovlivní sestřih pre-mRNA. Tím může tato metoda pomoci při stanovování patogenního potenciálu nových genetických variant. V neposlední řadě tato práce prokazuje jeden nový mechanizmus aktivace pseudoexonů a předkládá nový možný mechanismus poruchy rozpoznání akceptorového místa sestřihu. Závěr Tyto výsledky pomáhají objasnit význam sestřihových mutací u genů spjatých s rozvojem PID a přispívají k porozumění mechanismům sestřihových aberací. Zde zahrnutá evaluace různých in vitro a in silico metod může být přínosná jak pro genetickou diagnostiku, tak pro vývoj dalších predikčních nástrojů.

Abstract:

Background Gene variants can be both innoxious and deleterious, the later ones often underlying serious human diseases including primary immunodeficiencies (PIDs). The recognition of the deleterious variants is not always straightforward, as they may not affect the gene function directly (e.g. its protein coding potential), but rather indirectly by disturbing its expression regulation. The most prevalent 'regulatory' defect leading to human disorders is pre‑mRNA splicing aberration. Yet even the splicing‑affecting variants can be many times unrecognised, as the splicing regulators are highly degenerate and dispersed all over the whole gene. Even when recognised, neither the assessment of the aberrant splicing consequences and its impact on gene function is a simple task. Therefore, this work inspects the prevalence of splicing‑affecting mutations in the genes related to the PIDs development as well as in several other genes, explores the ways to recognize such mutations and to assess their impact on splicing pattern, and proposes some novel mechanisms leading to aberrant splicing. Methods One hundred eleven individual genes variants have been analysed by various in silico predictors. Sixty‑four of them were later analysed in vitro using splicing minigene assay and RT‑PCR of the patients'‑derived RNA, when available. Results The prevalence of splicing aberrations in PID-related genes turned out to be approximately 22 %. The in silico prediction tools gave reliable results for splice site affection, while were much less reliable for the changes of splicing regulatory elements. Yet three algorithms, ESRseq, EX-SKIP and Hexplorer showed promising results in the later category. Further, NNSplice and MaxEnt predictors indicated capability of assessing which cryptic splice site would be activated after authentic splice site disruption. In addition, we have proposed specific cut‑off values for discerning splicing‑affecting from non‑affecting variants at the exons first position. Next, comparison of the minigene analyses and the RT-PCR from patients' derived RNA indicated the former method as a useful tool helping assess the pathogenic potential of an inspected variant. Finally, regarding the mechanisms of aberrant splicing, the results showed a novel way of multiple pseudoexon activation and indicated possible novel mechanism of acceptor splice site recognition defect. Conclusions These findings help to elucidate the significance of splicing mutations in the PID-related genes and contribute to the understanding mechanisms of splicing aberration. Further, the evaluation of various in silico and in vitro approaches may come useful for both the diagnosticians and the developers of the in silico prediction tools.

Keywords

sestřih pre-mRNA, primární imunodeficience, varianty nejasného významu, aberace sestřihu, in silico predikce, minigenová analýza, pre-mRNA splicing, primary immunodeficiencies, variants of unknown significance, splicing aberration, in silico prediction, minigene assay

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 12. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 12. 4. 2017
• Supervisor: doc. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology