Biosyntéza a percepce cytokininů v topolu

Mgr. Pavel JAWOREK

Doctoral thesis

Biosynthesis and perception of cytokinins in poplar

Abstract:

Cytokininy jsou skupinou fytohormonů klíčovou pro regulaci růstu a vývoje rostlin. Podle charakteru postranního řetězce, vázaného na exocyklický dusík adeninu, se dělí na isoprenoidní a vzácněji se vyskytující aromatické. Jako modelový organismus pro studium metabolismu a percepce aromatických cytokininů vybrán Populus × canadensis cv. Robusta. Tento topol obsahuje ortho-topolin a jeho ribosid, který je zároveň vázán v tRNA. Podařilo se klonovat geny všech devíti topolových isopentenyltransferas (PcIPT), které kódují enzymy katalyzující první krok biosyntézy isoprenoidních cytokininů, a také všech pěti histidinkinasových receptorů cytokininů (PcHK). Jejich genová exprese byla napříč orgány topolu analyzována pomocí kvantitativní PCR. Funkčnost většiny PcIPT in vivo byla prokázána indukovatelnou expresí příslušných genů v Arabidopsis thaliana. Transgenní linie produkovaly značná množství metabolitů isopentenyladeninu a trans-zeatinu, ale u některých byly překvapivě zaznamenány i zvýšené hladiny cytokininů cis-zeatinového typu. PcHK byly exprimovány v Escherichia coli, navazující "live cell binding assay" umožnila stanovit ligandovou specificitu a pH optimum všech pěti rekombinantních proteinů. Většinu cytokininů během kompetičních testů vázala nejsilněji PcHK2. Dále byla ověřena kinasová aktivita receptorů, největší míru aktivace po vazbě ligandu vykazovala PcHK4a. Kvantifikací cytokininů před a po inkubaci s bakteriální kulturou bylo potvrzeno, že isopentenyladenosin je skutečný ligand topolových receptorů.

Abstract:

Cytokinins are phytohormones with a key role in the regulation of plant growth and development. They are divided into isoprenoid or aromatic group according to the nature of side chain bound to the exocyclic nitrogen atom of adenine. In this work, Populus × canadensis cv. Robusta was chosen as a model organism to study metabolism and perception of aromatic cytokinins as it contains ortho-topolin and its riboside, also bound in the poplar tRNA. All nine poplar isopentenyl transferase genes (PcIPT), coding enzymes fundamental for isoprenoid cytokinin biosynthesis, as well as all five cytokinin receptors hisidine kinase genes (PcHK) were cloned. The levels ofgene expression were analyzed using quantitative PCR across various poplar organs. The majority of PcIPTs was proved to be functional in vivo after their inducible expression in Arabidopsis thaliana. These transgenic lines produced substantial amounts of trans-zeatin and isopentenyl adenine metabolites. Suprisingly, levels of cis-zeatin type cytokinins were also elevated in some cases. PcHK were functionally expressed in Escherichia coli to perform live cell binding assay for determinantion of receptors ligand specificities and pH optima. The majority of cytokinins exhibited the strongest binding to PcHK2. Additionally, kinase activities of the receptors were verified, PcHK4a displayed the highest activation by ligand binding. The quantification of cytokinins before and after their incubation with bacterial cultures proved that isopentenyl adenosine is a true ligand of poplar receptors.

Keywords

aromatické cytokininy, histidinkinasa, isopentenyltransferasa, topol, tRNA

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 11. 2019

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Petr Tarkowski, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry