Studium interakce proteinů rodiny p53 s DNA modifikovanou novými typy fluorescenčních značek

Mgr. Martin Langer

Bachelor's thesis

A study of p53-family proteins interactions with DNA modified with novel types of fluorescent labels

Abstract:

Většina fluorescenčních technik používaných pro sledování DNA-protein interakcí využívá především terminálního značení používaných DNA prób. V této práci jsme se zaměřili na využití a aplikace cíleného fluorescenčního značení uvnitř DNA vazebných sekvencí. Enzymatická inkorporace modifikovaných 2′-deoxyribonukleosid trifosfátů (dNTPs) přestavuje jednoduchý způsob přípravy specificky značených DNA. Solvatochromní derivát 4-aminoftalimidu (API), jehož fluorescenční vlastnosti jsou ovlivněny polaritou vnějšího prostředí, byl přes linker konjugován na dCTP a byl použit pro přípravu DNA substrátů s API modifikovanými p53 vazebnými místy. Pomocí EMSA bylo zjištěno, že cílené API modifikace v rámci p53-specifické vazebné sekvence nezabrání vazbě proteinu p53 vázat se na tuto sekvenci. K vazbě proteinu p53 dochází i na stejným způsobem modifikovanou nespecifickou sekvenci. Pomocí měření fluorescence bylo zjištěno, že interakce samotných značených DNA substrátů s p53 byla spojena s postupným nárůstem intenzity fluorescence a se změnou profilu emisního spektra. Tento efekt nebyl pozorován v případě inkubace proteinem BSA, který se neváže na DNA. V případě kompetičního uspořádání (značený nespecifický vs. neznačený p53-specifický PEX produkt) byla prokázána preferenční vazba proteinu p53 na specifickou vazebnou sekvenci.

Abstract:

For most fluorescent techniques used in studies of protein DNA interactions, terminal labelling of probes is used. Here we focus on the use and application of targeted fluorescent labelling within the DNA binding sequences. Enzymatic incorporation of modified 2′ deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) provides a simple method for preparing specifically labelled DNA. Solvatochromic derivate of 4-aminophthalimide (API), whose fluorescence properties are affected by the polarity of the external environment, was via linker conjugated to dCTP and used for the preparation of DNA substrates with API modified p53 binding sites. Using EMSA it was revealed, that targeted API modification of p53-specific binding sequence did not abrogate the p53 protein binding to this sequence. Modified p53-nonspecific DNA substrates were bound by the protein as well. Fluorescence measurements revealed that interaction of labelled PEX products with p53 protein was associated with the gradual increase of the fluorescence intensity and the shift in the emission spectra profile. Neither effect was observed in case of incubation with the BSA, which does not bind to the DNA. Competition arrangement (labelled nonspecific vs. unlabelled p53-specific PEX product) demonstrated p53 binding preferentially to p53-specific sequence.

Keywords

Solvatochromní fluorofory, protein p53, 4-aminoftalimid, DNA próby, fluorescence

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2014
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry