Možnosti izolace a identifikace hygienicky významných bakterií ve vodách

Mgr. Kateřina Horáková, Ph.D.

Doctoral thesis

The possibilities of isolation and identification of health-related bacteria in water

Abstract:

Voda je přirozeným prostředím výskytu bakterií, kde kromě autochtonních druhů mohou přežívat i druhy hygienicky významné. Jejich přežívání ve vodním prostředí může vést k šíření různých druhů infekcí, z nichž některé mohou vážně ohrozit zdravotní stav člověka. Ke snížení rizika může přispět jejich rychlá a spolehlivá identifikace. Cílem předložené dizertační práce bylo zhodnocení možností izolace a identifikace hygienicky významných bakterií z vodního prostředí. Pozornost byla zaměřena na izolaci a identifikaci E. coli, intestinálních enterokoků, Clostridium perfringens, salmonel, legionel, Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus, jejichž stanovení ve vodách je vyžadováno legislativou. K izolaci a identifikaci byly využity klasické kultivační metody a biochemické testy a molekulárně biologické metody. K izolaci testovaných bakterií byly použity standardní kultivační metody (podle současně platné legislativy) a byla odzkoušena selektivně-diagnostická média s chromogenními a fluorogenními substráty. Identifikace testovaných bakterií byla provedena pomocí výše zmíněných kultivačních metod a doplňkových biochemických testů a s využitím molekulárně-biologických metod polymerázové řetězové reakce (PCR) a fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Důležitým krokem správného provedení PCR byl vývoj a optimalizace izolace bakteriální DNA. Pro vlastní identifikaci byly použity oligonukleotidové primery navržené pro detekci sekvencí genů specifických pro identifikované druhy/rody. Pro detekci více genů současně byla odzkoušena vícečetná amplifikace (multiplex PCR). Výsledky práce ukázaly, že izolace bakterií standardními metodami byly úspěšné pro všechny testované bakterie, výjimkou byla náročná izolace legionel z technických vod a nespecifická izolace intestinálních enterokoků pomocí chromogenního média. Pro správné zařazení všech testovaných bakterií do rodu či druhu bylo provedení základních biochemických identifikačních testů nezbytné. Jako dostačující se jevilo použití identifikačních postupů uvedených v legislativě. Při identifikaci E. coli se z testovaných postupů nejvíce osvědčila detekce enzymu -D-glukuronidázy. Nicméně při izolaci kmenů pomocí kultivačních metod byly zachyceny i kmeny s atypickými biochemickými vlastnostmi, které neumožnily jejich správnou identifikaci, což vedlo k podhodnocení nebo nadhodnocení výsledků. Pro izolaci DNA z čistých kultur poskytla nejlepší výsledky metoda alkalické lyze. Pro izolaci DNA přímo ze vzorků vod byla nejvhodnější modifikovaná Slusarenkova metoda v kombinaci se zakoncentrováním buněk filtrací a použitím skleněných kuliček k uvolnění buněk z filtru. Identifikace bakterií pomocí PCR byla úspěšná pro všechny testované bakterie, byly identifikovány i kmeny, které se kultivačními metodami nepodařilo správně určit. Publikované postupy PCR, včetně sekvencí primerů, musely však být v mnoha případech upraveny. Nově navržená metoda multiplex PCR (pro detekci sekvencí genů kódujících β-D-galaktosidázu, β-D-glukuronidázu, cytochromoxidázu d a galaktosidpermeázu) byla úspěšně odzkoušena pro specifickou identifikaci E. coli a její odlišení od blízce příbuzných shigel. Současná identifikace více druhů bakterií metodou multiplex PCR se nezdařila. Pro identifikaci legionel ve vzorcích vod byly otestovány metody kvantitativní PCR a FISH, které vykazovaly vyšší citlivost než metody kultivační. Výsledky aplikace molekulárně-biologických metod pro detekci a identifikaci hygienicky významných bakterií ve vzorcích vod ukázaly vyšší spolehlivost, specifičnost a citlivost než klasické metody kultivační.

Abstract:

Water is one of the natural environments for microorganisms, where besides autochthonic species health-related species can survive. Their survival in water environment can led to spread of various kinds of infections, some of which can endanger human health. Rapid and reliable identification of these microorganisms can lower the risk. The aim of the dissertation thesis is to evaluate possibilities of isolation and identification of health-related bacteria from water environment. The attention was paid to isolation and identification of E. coli, intestinal enterococci, Clostridium perfringens, salmonellae, legionellae, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, detection of which is required by the standards. For the isolation and identification classical cultivation methods and biochemical tests and methods of molecular biology were used. For the isolation of tested bacteria standard cultivation methods (according to the standards) were used and selectively-diagnostic media containing chromogenic and fluorogenic substances were tested. Identification of tested bacteria was carried out with above mentioned cultivation methods and additional biochemical tests and with the use of methods of molecular biology - polymerase chain reaction (PCR) and fluorescence in situ hybridization (FISH). The development and optimization of bacterial DNA isolation was the crucial step for proper PCR performance. For the identification oligonucleotide primers designed for detection of gene sequences specific for identified species/genus were used. For the simultaneous detection of more genes multiplex PCR was tested. The results of this study showed that the isolations of bacteria with standard methods were successful for all tested bacteria except for laborious isolation of legionellae from technical waters and non-specific isolation of intestinal enterococci on medium with chromogenic substances. Performance of basic biochemical identification tests was necessary for proper classification of all tested bacterial strains. The use of identification techniques found in the standards seemed to be sufficient enough for this purpose. Out of the widely known techniques for E. coli identification detection of -D-glucuronidase activity was found as the best. Nevertheless, isolation of bacterial strains using cultivation methods revealed several strains with atypical biochemical properties, which did not allow their proper identification and led to overestimated and underestimated results. For the DNA isolation from pure cultures alkaline lysis gave the best results. The most suitable method for DNA isolation from water samples was modified Slusarenko method in combination with concentration of cells by membrane filtration and the use of glass beads to release the cells from the filter. PCR identification of all tested bacteria was successful, even there were identified strains, which could not be properly identified biochemically. The published protocols had to be in many cases modified, including primers sequences. Newly designed multiplex PCR (for detection of sequences of genes coding for β-D-galactosidase, β-D-glucuronidase, cytochrome d oxidase and lactose permease) was successfully tested for specific identification of E. coli and its distinguishing from closely relative shigellae. The simultaneous PCR identification of more bacterial species failed. For the identification of legionellae in water samples quantitative PCR and FISH were tested. These methods proved to be more sensitive than cultivation methods. The results of application of molecular methods for detection and identification health-related bacteria in water samples showed higher reliability, specificity and sensitivity than cultivation methods.

Keywords

bakterie, indikátory, patogeny, voda, izolace, identifikace, kultivace, PCR, FISH bacteria, indicators, pathogens, water, isolation, identification, cultivation, FISH

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 29. 5. 2008
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Martin Rulík, Ph.D., RNDr. Miloslava Prokšová, CSc., RNDr. Dana Baudišová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Microbiology