Identifikace vhodných metod pro studium imunotoxicity na embryích Danio rerio

Mgr. Marek Pípal

Bachelor's thesis

Identification of immunotoxicity methods on Danio rerio embryo model

Abstract:

Danio rerio je velmi perspektivní modelový organizmus užívaný v ekotoxikologii, toxikologii i dalších oborech. Řada publikovaných studií a získaných informací o ontogenezi, fyziologii a vlastnostech tohoto organismu je využívána při specifických aplikacích embryonálního testu s Danio rerio v toxikologii. Jedním z hlavních směrů vývoje je nalezení a popis citlivých molekulárních markerů toxických efektů. Tento směr se uplatňuje i v oblasti imunotoxikologie a díky tlaku na využívání jiných než savčích modelů pro testy toxicity získává embryonální test čím dál větší váhu. V rámci výzkumu imunotoxicity různých látek je sledován jejich vliv na expresi genů spojených s imunitou, především pomocí metody molekulární biologie kvantitativní RT-PCR. Existuje již řada genů, jejichž odpověď na supresi či stimulaci imunitního systému vyvolanou chemickými látkami je poměrně dobře popsána a tyto poznatky by mohli umožnit použití embryí Danio rerio pro testování imunotoxicity environmentálních vzorků. V této práci byly nalezeny a charakterizovány markery pro hodnocení imunotoxických vlivů odtoků čistíren odpadních vod, pomocí kvantitativní RT-PCR na embryích Danio rerio. K tomuto účelu byly vybrány 2 geny spojené s neadaptivní imunitou (TNFα a Il-1-β) a 2 geny spojené s adaptivní imunitou (rag 1 a rag 2). Jako pozitivní kontrola byla pro své známé imunomodulační vlastnosti vybrána látka forskolin. Byl proveden pilotní experiment s genem rag 2 a forskolinem. V tomto experimentu byla embrya exponována koncentraci 200 ng/l forskolinu a byl prokázán stimulační efekt forskolinu na gen rag 2, jehož exprese byla po expozici 200 ng/l forskolinu oproti kontrole zvýšena 33 násobně.

Abstract:

Danio rerio is a very promising model organism used in ecotoxicology, toxicology and other disciplines. Versatile applicability of the embryo model with Danio rerio in toxicology is based on properties of this model (in vivo model with relatively easy maintenance) and extensive literature data from many scientific areas including ontogenesis, physiology, toxicology, and immunology. One of the main novel research directions is to find and describe sensitive molecular markers of toxic effects. The Danio rerio embryo model is a non-animal alternative to standard mammalian assays in immunology and immunotoxicology. Quantitative RT-PCR is used to describe sensitive genes modulated by immunotoxic chemicals. Response of several genes to immunotoxic chemicals is relatively well documented, which creates a potential to use some of these genes for environmental samples immunotoxicity testing. In this work were identified and characterized markers for the assessment of immunotoxic effects using quantitative RT-PCR on Danio rerio embryos. For this purpose, two genes associated with non-adaptive immunity (TNFα and Il-1-β) and two genes associated with adaptive immunity (rag 1 and rag 2) were selected. Substance forskolin was chosen as positive control for its known immunomodulatory properties. A pilot experiment was performed with the gene rag 2 and forskolin. Embryos were exposed to concentration of 200 ng/l forskolin. The stimulatory effect was proven on the gene rag 2, which expression increased 33 times compared to control after exposure to 200 ng/l forskolin.

Keywords

Danio rerio, embryonální test, imunotoxicita, odpadní vody, kvantitativní RT-PCR, embryo model, immunotoxicity, effluent waters, quantitative RT- PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 6. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2012
• Supervisor: Ing. Adam Jonáš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / General Biology