Racionální návrh smyček aktivního centra v dioxygenázach s použitím metod molekulového modelování

Bc. Karol Jakab

Bachelor's thesis

Rational design of active-site loops in dioxygenases using molecular modelling methods

Abstract:

Tato práce se zaměřuje na racionální návrh enzymů z rodiny Rieske dioxygenáz s použitím výpočetních metod molekulového modelování. Hlavním cílem byl návrh dioxygenáz se zvýšenou aktivitou na vybraných substrátech čtyř seskviterpenů. Sestavili jsme strategii pro in silico racionální návrh enzymů – chimér pomocí transplantace specifických smyček do pečlivě vybraných příjemců ve formě struk-turních homologů – dioxygenáz. Proces návrhu byl založen na znalosti mutantních smyček u vstupu do aktivního místa, které byly objeveny během předchozí práce na vývoji smyček u variant cumene-dioxygenázy. Přítomnost těchto smyček způsobila zvýšenou aktivitu enzymů na seskviterpenech. Volba vhodného enzymu – příjemce pro transplantaci těchto smyček byla založena na kritériích strukturní podobnosti a vazebné afinity seskviterpenů v katalytické dutině. Výsledkem naší strategie návrhu byla sada řešení v podobě sekvencí a 3D strukturních modelů nových dioxygenáz, které byli sestaveni pomocí nového webserveru LoopGrafter. Dál byly vyhodnoceny predikce stability a vazebné afinity těchto řešení. Pět návrhů s nejlepšími skóre bylo vybráno pro testování jejich aktivity v biochemickém laboratoriu. V závislosti na výsledcích laboratorních testů může být tato strategie vylepše-na a případně použita v budoucnosti na účely návrhu dalších enzymů s žádoucími vlastnostmi.

Abstract:

This thesis is focused on rational design of Rieske dioxygense enzymes using com-putational and molecular modelling methods. Main goal was to design such enzymes with improved activity towards four selected sesquiterpenes as substrate. In silico rational design strategy was devised to produce chimeric enzymes by transplantation of specific loops into target scaffolds of rationally selected structur-ally homologous dioxygenases. The design process relied on the active-site gating mutant loops discovered during previous loop-engineering work with cumene diox-ygenase variants. Presence of these loops in these enzyme variants conferred im-proved activity towards sesquiterpenes. Selection of suitable scaffolds to serve as targets for transplantation was based on criteria of structural similarity and binding affinity of sesquiterpenes inside their catalytic pockets. Implementation of our strat-egy resulted in a set of solutions in form of both sequences and 3D structural mod-els of novel dioxygenases constructed using the new LoopGrafter web server. These solutions were further evaluated for their predicted stability and binding affinity with the substrates of interest. Based on these criteria, the five best scoring designs were ranked and selected for upcoming experimental evaluation of their activity in biochemical laboratory. Hopefully, depending on the results of experimental evaluation, our strategy might be refined and potentially used in the future to design more novel enzymes with desired properties.

Keywords

Rational design of enzymes, protein engineering, molecular modelling, loop grafting, active-site loops, Rieske oxygenase, dioxygenase, Racionální návrh enzymů, proteinové inženýrství, molekulové modelování, transplantace smyček, smyčky aktívního centra, Rieske oxygenáza, dioxzgenáza

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 1. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 2. 2. 2023
• Supervisor: PhD. Sérgio Manuel Marques
• Reader: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Bioinformatics