Detekce reziduálních histonů ve spermiích savců

Bc. Andrea Zvěřinová

Master's thesis

Detection of residuals histones in the mammals spermatozoa.

Abstract:

Během spermatogeneze dochází ke změnám chromatinu, které jsou doprovázeny záměnou histonů za protaminy, neboli protaminací. Po protaminaci ve spermii detekujeme reziduální množství histonů, které je druhově specifické. Zatímco dříve byla přítomnost reziduálních histonů považována za nedostatečnost protaminace, v součané době je zjevné, že histony a jejich post-translační modifikace hrají důležitou roli ve struktuře spermie, v procesu oplození a v časném embryonálním vývoji. Souhrn post-translačních modifikací histonů, nejčastěji metylace, fosforylace, ubikvitinace a sumoylace je označován jako histonový kód. Na základě dosavadního poznání histonového kódu byla stanovena hypotéza, že post-translační modifikace histonů ve spermiích savců ovlivňují fyziologické funkce spermií, vyjádřené jejich životaschopností a motilitou. Pro experiment byly použity myší spermie od samců z kmene CD1 a lidské spermie odebrané od pacientů kliniky Genetika Plzeň s.r.o. Ejakulát byl zpracován a hodnocen na základě manuálu WHO. Spermie byly analyzovány metodou imunocytochemického barvení, průtokové cytometrie a western blotu. Byly analyzovány následující post-translační modifikace ve spermiích myši a člověka: dimethylace histonu H3 na lysinu K4 (H3K4me2), fosforylace histonu H2AX na serinu 139 (gammaH2AX). Následně došlo ke korelaci těchto histonových modifikací v lidských spermiích s jejich mitochondriálním stavem po barvení MitoTrackerem a motilitou. Z kvantifikací signálu pro vybrané histonové modifikace je patrné, že mezi jedinci je výrazná individuální variabilita. Výsledky experimentu ukázaly, že vzorky s nejvyšším zastoupením progresivně se pohybujících spermí zároveň vyjadřují jedny z nejvyšších hodnot intenzity fluorescence MitoTrackeru. Dále bylo zjištěno, že množství H3K4me2 je nepřímo úměrné motilitě spermií. Lze předpokládat, že H3K4me2 je histonovým kandidátem použitelným jako negativní marker motility spermií.

Abstract:

During spermatogenesis there are changes in chromatin which are accompanied by histone-protamin replacement, called protamination. After protamination there is residual amount of histones, which species specific. In the past, the presence of residual histones was considered to bet he insufficiency of protamination, on the other hand, histones and their post-translational modification plays an important role in sperm structures, the proces if fertilization and in early embryonic development. The index of post-translational modifications of histones, such as methylation, phosphorylation, ubiquitination or SUMOylation, is called the histone code. Based on existing knowledge of the histone code, the hypothesis, that post-translational modifications of histones in mammalian sperm cells affect physiological functions expressed by their motility and sperm viability, has been established. In addition to sperm of mice CD1 strain was used for experiment, human sperm was collected from patients of Genetika Plzen s.r.o. clinic. Semen was prepared and assessed in accordance with the WHO manual. Sperm cells were analyzed using immunocytochemical staining, western blot and flow cytometry. There were analyzed following post-translational modifications: dimethylation of histone H3 at lysine K4 (H3K4me2), phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (gammaH2AX). Consequently, there was a correlation of these histone modifications in human spermatozoa with their mitochondial condition (after the MitoTracker staining) and their motility. For quantifying the signals for selected histone modification, there is obvious significant individual variability of individual sperm samples. The results of experiment show that the samples with the highest percentage of progressive motile sperm also have the highest intensity of fluorescence of MitoTracker. Furthemore, the quantity of H3K4me2 shown that this histone modification is a candidate useful as a negative marker of sperm motility.

Keywords

spermie, histon, histonový kód, oplození, průtoková cytometrie

Keywords

sperm, histone, histone code, fertilization, flow cytometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Kristýna Hošková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction