Příprava a transformace protoplastů jednoděložných rostlin a jejich využití pro studium lokalizace proteinů cytokininového metabolismu

Bc. Karolina ŠENKOVÁ

Master's thesis

Preparation and transformation of monocot protoplasts and their use for localization studies of cytokinin metabolism-related proteins

Abstract:

Genetické inženýrství zahrnuje jako nepostradatelný nástroj pro přípravu transgenních organismů metody genetické transformace. Konkrétně u rostlin jsou některé z nich díky své dostupnosti a robustnosti dobře zavedené a často využívané transformace zprostředkovaná Agrobacterium tumefaciens, biolistické metody či elektroporace. Další alternativní metody jsou využívány naopak méně transformace pomocí polyethylenglykolu, karbidu křemíku, liposomů nebo mikroinjekce. Cytokininy jsou významné rostlinné hormony mající mnoho funkcí a zajišťující nezbytné pochody při růstu a vývoji. Určení subcelulární lokalizace enzymů cytokininového metabolismu je důležité pro pochopení jejich funkce i vzájemné provázanosti. Cílem této práce bylo optimalizovat podmínky pro izolaci protoplastů z jednoděložných rostlin a jejich transientní transformaci s důrazem na zvýšení její účinnosti. Postup byl následně shrnut do přehledného protokolu. Tato metodika byla použita pro subcelulární lokalizaci vybraných enzymů cytokininového metabolismu: cytokinindehydrogenas, nukleosid-N-ribohydrolas a aldehyddehydrogenas ve fúzi s GFP pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu. Pro potvrzení signalizační funkce N-terminálních sekvencí vybraných isoforem ZmCKX byla provedena stabilní exprese v buněčné suspenzní kultuře A. thaliana Ler za použití GFP-fúzních konstruktů obsahujících deleci těchto předpokládaných signálních peptidů.

Abstract:

Genetic engineering involves several methods of genetic transformation as a mean to obtain transgenic organisms. Some of them are due to their availability and robustness well established and frequently used Agrobacterium-mediated transformation, biolistic methods or electroporation. Alternative methods, for example PEG-mediated transformation, silicon carbide or liposome mediated transformation and microinjection are used less often. Cytokinins are important plant hormones playing key roles in numerous developmental and physiological processes. Determining their subcellular localization is important for understanding their function and possible interactions. The aim of this work is to optimize the conditions for protoplast isolation and their transient transformation with the emphasis on increasing the efficiency. The procedure was subsequently summarized in a several-step protocol. This methodology was used with the aim to study the subcellular localization of selected enzymes involved in cytokinin metabolism cytokinin dehydrogenases, nucleoside N-ribohydrolases and aldehyde dehydrogenases. All proteins were prepared as fusions with GFP and the localization was studied using laser scanning confocal microscopy. To confirm the signaling function of N-terminal sequence of selected ZmCKX isoforms, stable expression in A. thaliana Ler suspension culture using GFP-fusion constructs containing deletion of these predicted signal peptides was performed.

Keywords

protoplasty, transformace, subcelulární lokalizace, CKX, NRH, ALDH, Zea mays

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 4. 2016

Accessible from:: 28. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry