Strukturní studie 3C proteázy a 3D replikázy včelího viru deformovaných křídel

Bc. Dorota Rousová

Master's thesis

Structural studies of 3C protease and 3D replicase of deformed wing virus

Abstract:

Včela medonosná (Apis mellifera) je nejdůležitější opylovač. Mezi patogeny virového původu s největším vlivem na vitalitu včelstev patří virus deformovaných křídel (DWV) z čeledi Iflaviridae, řádu Picornavirales. Genom DWV je translatován do polyproteinu, který je štěpen na funkční proteiny virovou 3C proteázou (3Cpro) nebo jejím prekurzorem 3CD. Replikace genomu je zajišťována virovou 3D polymerázou (3Dpol). Správné funkce 3Cpro, 3Dpol a 3CD jsou nezbytné pro replikaci DWV. Proto jsou tyto proteiny potenciální cíle antivirotik. Znalost struktury a biologických vlastností těchto proteinů poskytne podklady pro design specifických inhibitorů. Tato práce je zaměřena na molekulárně-biologickou a strukturní charakterizaci 3Cpro, 3Dpol, 3CD DWV a jejich komplexu 3CD-3D. 3Cpro patří mezi cysteinové proteázy. Sekvenční a mutační analýzou jsme identifikovali His63 a Cys200 jako katalytické aminokyseliny 3Cpro. Mutace H63A+C200A 3CD prekurzoru proteázy vedly k eliminaci jeho proteolytické aktivity. Strukturu 3Cpro DWV jsme studovali pomocí rentgenové krystalografie. Difrakční data byla nasbírána na synchrotronu do rozlišení 2,4 Å. Komplex 3CD-3D byl izolován gelovou filtrací a následně studován pomocí kryo-elektronové mikroskopie a maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS). Tato data umožní budoucí vyřešení struktur 3Cpro, 3Dpol a 3CD DWV a případný vývoj inhibitorů DWV. Vzhledem k sekvenčním podobnostem proteáz a polymeráz iflavirů lze předpokládat účinek inhibitorů i na další včelí viry.

Abstract:

Western honey bee (Apis mellifera) is the most important pollinator. Deformed wing virus (DWV) from family Iflaviridae, order Picornavirales belongs among pathogens with the biggest impact on bee vitality. DWV genome is translated into a polyprotein that is cleaved into functional proteins by virus-encoded 3C protease (3Cpro) or its precursor 3CD. Genome replication is performed by virus-encoded 3D polymerase (3Dpol). Functional 3Cpro, 3Dpol and 3CD are essential for DWV replication. Therefore, these proteins are targets for antiviral compounds. Knowledge of structures and biological properties of these proteins will enable design of inhibitors. This thesis is focused on molecular and structural characterization of 3Cpro, 3Dpol, 3CD DWV and their complex 3CD-3D. 3Cpro belongs among cysteine proteases. Using sequence and mutational analysis, we identified His63 and Cys200 as catalytic amino acids of 3Cpro. Mutations H63A+C200A of 3CD protease precursor eliminated its proteolytic activity. We studied structure of 3Cpro by X-ray crystallography. Diffraction data were collected on synchrotron to a resolution of 2,4 Å. Complex of 3CD-3D was isolated by gel filtration and subsequently studied by cryo-electron microscopy and small-angle X-ray scattering (SAXS). These data will enable future determination of structure of 3Cpro, 3Dpol and 3CD DWV and potentially design of DWV inhibitors. Due to sequence similarities of proteases and polymerases of iflaviruses, we can expect that the DWV inhibitors will affect also other honey bee viruses.

Keywords

včelí viry, Picornavirales, Iflaviridae, virus deformovaných křídel, struktura, 3C proteáza, 3D polymeráza, 3CD prekurzor, krystalizace, rentgenová krystalografie, katalytická triáda, mutageneze, klonování, purifikace, honey bee viruses, deformed wing virus, structure, 3D protease, 3D polymerase, 3CD precursor, crystallization, X-ray crystallography, catalytic triad, mutagenesis, cloning, purification

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 6. 6. 2017
• Supervisor: Mgr. Pavel Plevka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry