Deciphering the ROS-auxin crosstalk with GROWTH REGULATING FACTOR 5 to regulate chloroplast division in the leaf of Arabidopsis thaliana

Eman Elrefaay Ryad, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

Vývoj listů zahrnuje po sobě následující fáze buněčné proliferace a buněčné expanze. Během fáze proliferace se chloroplasty extensivně dělí a po přechodu od buněčné proliferace k expanzi diferencují na fotosynteticky aktivní chloroplasty. Nadměrná exprese genu pro GROWTH REGULATING FACTOR5 (35S:GRF5) stimuluje buněčné dělení i dělení chloroplastů, což vede ke zvětšení plochy listu se zvýšeným počtem chloroplastů na buňku. Dále se předpokládá možná funkce homeostázy auxinu a změny v redoxním stavu buňky spojeného s produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) v koordinaci dělení chloroplastů a buněčného dělení prostřednictvím GRF5 zprostředkované indukce exprese genů biosyntézy chlorofylu. Nicméně naše znalost mechanismů regulace dělení chloroplastů je stále ve velmi raném stádiu a zapojení auxinu do tohoto procesu zůstává nejasné. S cílem prohloubit naše porozumění role auxinu ve vývoji chloroplastů a toho, jak redoxní stav chloroplastů ovlivňuje dělení buněk i chloroplastů, využili jsme genetické nástroje k dešifrování domnělé molekulární podstaty interakce mezi auxinem a GRF5. Vzhledem k centrálnímu významu ROS v redox signalizaci na rozhraní mezi fytohormony a vývojovými regulacemi jsme se zaměřili na zkoumání toho, jak změny v auxinu a redoxním stavu buněk během vývoje listů ovlivňují populaci chloroplastů v diferencovaných buňkách listů. Byli získáni kříženci mezi 35S:GRF5 a různými liniemi souvisejícími s auxinem a byly aplikovány exogenní auxiny a modulátory produkce ROS. Zjistili jsme, že nadměrná exprese GRF5 silně zvyšuje endogenní hladiny IAA. Pozorovali jsme, že pro zvýšení množství chloroplastů prostřednictvím nadprodukce GRF5 v diferencujících se listových buňkách jsou nezbytné funkční transportéry auxinu z rodiny PILS. Kromě toho nadměrná exprese UGT74E2 kódující UDP-glukosyltransferázu a také manipulace produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) v chloroplastech působily proti účinkům pozorovaným u linií 35S:GRF5. Na základě těchto a dalších zjištění navrhujeme model, ve kterém GRF5 řídí dělení chloroplastů prostřednictvím regulace homeostázy IAA, pravděpodobně mechanismem citlivým na produkci ROS. Naše výsledky ozřejmují způsob, jakým signální dráhy GRF5, ROS a auxin spolupracují při synchronizaci chloroplastů a buněčného dělení.

Abstract:

Leaf development relies on subsequent phases of cell proliferation and cell expansion. During the proliferation phase, chloroplasts need to divide extensively and differentiate into photosynthetically active chloroplasts after the transition from cell proliferation to expansion. Over-expression of GROWTH REGULATING FACTOR5 (35S:GRF5) enhances cell division and chloroplast division resulting in an enlarged leaf area with increased chloroplast number per cell. Moreover, a possible function of auxin homeostasis together with changes in the reactive oxygen species (ROS) production associating with cell's redox state modifications are proposed to coordinate chloroplast division and cell division via GRF5-mediated induction of chlorophyll biosynthesis genes expression. Knowledge of how chloroplast division is regulated is still in the infant stage, and auxin involvement in this process remains mostly unidentified. In order to deepen our understanding of the role of auxin in chloroplast development and how the chloroplast redox state influences the cell and chloroplast division, we have used genetic tools to decipher the putative molecular basis for the crosstalk between auxin and GRF5 pathways. Due to the central positioning of ROS-redox signaling at the interface between phytohormones and developmental responses, we aimed to investigate how changes in auxin and cell redox status during leaf development impact the chloroplast population in a mature leaf cell. Crosses between 35S:GRF5 and different auxin-related lines were generated. Moreover, exogenous treatments of auxin and ROS-propagators were applied. We found that overexpression of GRF5 strongly upregulates endogenous IAA levels. We observed that functional auxin transporters from the PILS family are necessary for the GRF5-mediated upregulation of chloroplast amounts in the expanded leave cells. Furthermore, the overexpression of UGT74E2 encoding the UDP- glucosyltransferase as well as manipulation of ROS production in the chloroplasts counteracted the effects observed in 35S:GRF5 lines. Based on these and other findings, we propose a model in which GRF5 controls chloroplast division via regulating IAA homeostasis, possibly in the ROS-sensitive manner. Our results are expected to shed light on how GRF5, ROS, and auxin signaling pathways work together to synchronize chloroplast and cell division.

Keywords

Leaf, chloroplast, auxin, GROWTH REGULATING FACTOR 5, ROS

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 1. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 30. 1. 2023
• Supervisor: doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D.
• Reader: Ing. Jozef Balla, Ph.D., doc. Mgr. Martin Černý, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics