Synthesis of peptide and their application for cell penetration and drug delivery

Ing. Vedran Milosavljević

Doctoral thesis

Syntéza peptidů, jejich konjugace, značení a použití pro penetraci tumorových buněk a transport léčiv

Abstract:

Biologická funkce a přežití buněk jsou spojeny s ničím nerušenou funkcí buněčné membrány. Hydrofobní povaha její lipidové dvojvrstvy chrání buňky před nežádoucím vstupem molekul. To také omezuje příjem terapeutických molekul, včetně nukleových kyselin, proteinů, nano-sloučenin, drobných léčiv (doxorubicin, cisplatin, taxol a cyklosporin). Dodání terapeutických molekul ke konkrétním intracelulárním cílům a neomezené zvýšení propustnosti membrány může být dosaženo použitím dodávacích vektorů. Použití penetračních peptidů (CPP) pro dodávání léčiv představuje bezpečný způsob, jak dodat léky s minimálně toxickým účinkem a zároveň obejít problém biologické dostupnosti léčiva. CPP jsou schopny dodat různé kovalentně nebo nekovalentně konjugované náklady, jež samy nemají schopnost proniknout do buňek, ke široké škále intracelulárních a dokonce i intranukleárních cílů. Cílem této práce bylo navrhnout a postavit naložený nanotransporter složený z penetračních peptidů a známého nebo nového, potenciálně terapeutického léčiva, popsat tvorbu vazby mezi penetračním peptidem a terapeutickými molekulami a účinně doručit léčiva. CPP byly vyrobeny syntézou na pevné fázi za použití mikrovlnně podporované metody, přičemž čištění bylo provedeno rychlou proteinovou kapalinovou chromatografií (FPLC). Kapacita vázaní léčiva a uvolňování léčiva bylo pozorováno za podmínek, které odpovídají těm v extracelulárním a intracelulárním prostředí. Interakce mezi CPP a léčivy byla zkoumána za použití MALDI-TOF MS, Fourierové infračervené spektroskopie (FTIR) a elektrochemické metody. Dodávací účinky konjugátů byly testovány na lidských a bakteriálních buňkách. Tato studie ukazuje aplikaci penetračních peptidů s cílem popsat strategii buněčně specifického doručení léků a zvyšit aktivaci léčiv změnou fyziologických podmínek. Také bylo ukázano, že existuje značný potenciál peptidů jako transportérů léčiva, kteréý by mohl být užitečný v budoucnu jako multifunkční činidlo v selektivní terapií ošetření různých nemocí.

Abstract:

Biological function and survival of cells is connected with undisturbed functionality of cellular membrane. The cells are protected from unwanted molecules entry by hydrophobic nature of cell membrane lipid bilayer. This also limits the uptake of therapeutic molecules including nucleic acids, proteins, nano-compounds, small drugs (doxorubicin, cisplatin, taxol, and cyclosporine). Delivery of therapeutic molecules to specific intracellular targets and increase of membrane permeability without limitations can be accomplished by using delivery vectors. Application of cell penetrating peptides (CPPs) for drug delivery represents a safe way to deliver drugs with minimal toxicity effect and bypass the problem of drug bioavailability. CPPs are able to deliver various cell-impermeable, covalently or non-covalently conjugated cargos to a wide range of intracellular and even intranuclear targets. The purpose of this work was to design and construct a loaded nanocarrier composed of CPPs and known or new potentially therapeutic drugs, describe the formation of bond between CPPs and therapeutic molecule and effectively deliver the drugs. Production of CPPs was done by solid phase synthesis using microwave assisted method, while purification was done by fast protein liquid chromatography (FPLC). Drug binding capacity and release was observed under the conditions corresponding to the ones in extracellular and intracellular environment. Interaction between CPPs and drugs was investigated using MALDI-TOF MS, FTIR and electrochemical method. The delivery effects of conjugates were tested on human and bacterial cells. The present study demonstrates applications of cell penetrating peptides for cell-specific delivery strategies and increasing activation of drugs by changing physiological conditions. Also it was shown that there is a considerable potential of peptide as carriers for drug-delivery, which could be helpful in the future as multifunctional agent in selective therapy for various disease treatments.

Keywords

penetrační peptidy, syntéza na pevné fázi, dodávání léčiva

Keywords

Cell penetrating peptides, solid phase synthesis, drug delivery

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 19. 6. 2017
• Supervisor: doc. RNDr. Pavel Kopel, Ph.D.
• Reader: Petr Babula, PharmDr., Ph.D., Miroslav Pohanka, prof. RNDr., Jana Drbohlavová, externi

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Doctoral programme / field:
Chemistry / Agricultural Chemistry