Variabilita genu SOD1 a její vztah k degenerativní myelopatii u plemene bernský salašnický pes

Simona Mršťáková

Master's thesis

Variability of SOD1 gene and its relation to degenerative myelopathy in breed Bernese Mountain Dog

Abstract:

Teoretická časť tejto diplomovej práce podáva informácie o vlastnostiach bernského salašníckeho psa, histórii a najčastejšie sa vyskytujúcich dedičných ochoreniach tohto plemena. Hlavná časť literárneho prehľadu je zameraná na informácie o SOD 1 géne, jeho lokalizácii, štruktúre, funkcii a polymorfizmech u ktorých je predpokladaná asociácia s ochorením degeneratívna myelopatia. Tiež je popísané toto ochorenie z hľadiska klinických príznakov, diagnostiky, liečby a podobnosti s amyotrofickou laterálnou sklerózou u človeka. Ďalej sú uvedené popisy laboratórnych metód, ktoré boli použité pre výskumnú časť, ako je PCR, PCR-RFLP, separačná elektroforéza a Sangerova sekvenácia. Druhá časť práce rozoberá postupný vývoj metodiky použitej pre vedecký experiment. Podrobne popisuje postup izolácie a následného spracovania DNA metódou PCR-RFLP a Sangerovou sekvenáciou. Uvádza výber primerov a vhodných restrikčných enzýmov na detekciu kauzálnych mutácií SOD1:c.118G>A a SOD1:c.52A>T vedúcich k degeneratívnej myelopatii. Tiež sú tu uvedené informácie o procese sekvenácie okolia exónu 1 génu SOD1 a navrhnutia nového metodického postupu detekcie mutácie SOD1:c.52A>T pomocou kapilárnej elektroforézy na základe zistenia prítomnosti inzertu. Posledná časť tejto diplomovej práce zobrazuje získané výsledky a ich štatistické vyhodnotenie. Celkovo bolo do štúdie zahrnutých 303 bernských salašníckych psov, z čoho 42,57 % bolo heterozygótnych a 5,94 % bolo homozygótnych v mutácii SOD1:c.118G>A. Z rovnakej skupiny jedincov bolo 75 heterozygótov v mutácii SOD1:c.52A>T a 5 boli v tejto mutácii homozygotní. Jedinci boli rozdelení do kategórií podľa pohlavia, veku a pôvodu, následne boli jednotlivé kategórie medzi sebou porovnané. Pomocou x2 testu bolo zistené, že neexistujú na hladine významnosti L=0,05 štatisticky významné rozdiely medzi frekvenciami výskytu jednotlivých genotypov a alel medzi jednotlivými skupinami. V tejto časti je tiež popísaná získaná sekvencia okolia exónu 1 SOD1 génu, ktorá doposiaľ nebola uvedená v žiadnej dostupnej genomovej databáze. Výsledky diplomovej práce poskytli informácie o polymorfizmoch génu SOD1 asociovaných degeneratívnou myelopatiou a na základe následných populačných analýz i zhodnotenie výskytu jednotlivých mutovaných alel v populácii bernského salašníckeho psa. Dáta môžu byť využité pri zostavovaní vhodných chovných párov, a tým dopomôcť k zníženiu výskytu degeneratívnej myelopatie v chove.

Abstract:

The theoretical part of the diploma thesis reports characteristics, history and health status of the breed Bernese Mountain Dog. The main part of literature review focuses on information about localization, structure and function of SOD1 gene and polymorphisms associated with degenerative myelopathy. This disease is described in terms of clinical signs, diagnose, treatment and similarities with amyotrophic lateral sclerosis. The following are descriptions of laboratory methods used in the research part of the thesis, such as PCR, PCR-RFLP, gel electrophoresis and Sanger's sequencing method. Second part of this thesis analyzes the gradual development of the methodology used for scientific experiment. Procedure of isolation and afterwards treatment of DNA by PCR-RFLP and Sanger's sequencing method is described in details. Given is the process of designing primers and restriction enzymes for detection of causal mutation SOD1:c.118G>A and SOD1:c.52A>T leading to degenerative myelopathy. The research section also contains information about sequencing an area of exon 1 SOD1 gene. The new method to detect mutation SOD1:c.52A>T according to location of insert by using capillary electrophoresis was suggested. Last part deals with gained results and statistic evaluation. Samples of DNA were collected and tested from 303 Bernese Mountain Dogs. Tests for mutation SOD1:c.118G>A shows, that 42,57 % of these dogs were heterozygous and 5,94 % dogs were recessive homozygous. 75 dogs tested for mutation SOD1:c.52A>T were heterozygous and 5 dogs were recessive homozygous in this mutation. Individuals were divided into several groups (gender, origin, age), which were than compared with each other. The statistical survey (x2 test, L=0,05) involving comparing the frequency of genotypes and alleles in established groups didn't show any statistically important differences. In this part, there are also described results of sequencing area surrounding exon 1 of SOD1 gene, which wasn't published in any international genome database yet. This thesis presents information about SOD1 polymorphism associated with degenerative myelopathy and the evaluation of recessive alleles incidence in population of Bernese Mountain Dog. Presented data can be used for forming of breeding couples and thus decreasing the frequency of degenerative myelopathy.

Keywords

pes domáci, Canis lupus f. familiaris, bernský salašnícky pes, degeneratívna myelopatia, SOD1, c.118G>A, c.52A>T, sekvenácia

Keywords

dog, Canis lupus f. familiaris, Bernese Mountine Dog, degenerative myelopathy, SOD1, c.118G>A, c.52A>T, sequencing

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction