Změna abundance mRNA, oxidativních produktů a aktivit antioxidačních enzymů spojených se stárnutím rybích oocytů

MSc. Azadeh MOHAGHEGHI SAMARIN

Doctoral thesis

Alteration of mRNA abundance, oxidation products and antioxidant enzyme activities associated with fish oocyte ageing

Abstract:

Opožděná přirozená reprodukce či umělý výtěr oocytů, a také jejich pozdější oplodnění při umělém výtěru vede k jejich stárnutí a následně přezrávání. I v dnešní době jsou ovšem znalosti o procesu stárnutí oocytů ryb nebo vyšších obratlovců velmi omezené. Některé studie prováděné na vyšších obratlovcích předpokládají, že na stárnutím oocytů má největší vliv zejména oxidativní stres. Tato práce se zabývá možnými změnami v mRNA transkriptu, který je způsobený oxidativním poškozením buněk, mitochondriální funkcí a stresovou reakcí a souvisí s následnou oplozeníschopností oocytů, vývojem embryí, transkripční regulací a cyklem buněk, a také apoptózou během přezrávání oocytů. Tato práce také sleduje oxidativní stavy oocytů během post-ovulačního stárnutí pomocí hodnot TBAR jakožto ukazatele oxidace lipidů a karbonylů ukazujících na prodloužení oxidace proteinů. Dále byla role oxidativního stresu v průběhu stárnutí oocytů hodnocena pomocí sledování aktivity antioxidačních enzymů jako jsou: CAT, SOD, GPX a GR. Dalšími hodnocenými parametry byly změny v jednotlivých skupinách lipidů, mastných kyselin, životaschopnosti oocytů a ploidní úroveni vylíhnutých larev. V případě sumečka afrického (Clarias gariepinus) dochází k přezrání oocytů 16 hodin po výtěru při jejich uchovávání v teplotě 25°C a za 24 hodin po výtěru u jiker skladovaných při 4°C. V případě obou sledovaných teplot bylo pozorováno postupné zvyšování mortality a počtu deformovaných larev v průběhu jejich uchovávání. Nejvyšší mortalita a nejnižší kvalita larev byly zaznamenány u nejdéle uchovávaných oocytů. Dále byl u vybraných druhů ryb stanoven čas, po který si jejich oocyty stále zachovávaly vysokou oplozeníschopnost. U lína obecného (Tinca tinca) je to 10 hodin při teplotě 20 °C, u karase zlatého (Carassius auratus) 18 hodin při 20 °C a v případě kapra obecného (Cyprinus carpio) je to 14 hodin po ovulaci a 10 hodin po umělém výtěru při 20 °C. Z výsledků práce je patrné, že v průběhu stárnutí oocytů nedošlo k žádné průkazné změně mRNA genů týkajících se oxidativního stresu a genů zapojených do buněčného cyklu během procesu stárnutí oocytů u sumečka afrického, karase zlatého a kapra obecného. Navíc u sledovaných druhů nedošlo v průběhu stárnutí oocytů ke změně hodnot TBAR a karbonylů. Avšak bylo pozorováno zvýšené množství mRNA apopticky příbuzných genů. Analýza antioxidačních enzymů nezaznamenala významné změny v hodnotách CAT a SOD během stárnutí oocytů po jejich získání u kapra obecného, karase zlatého a lína obecného. Nicméně významně snížená aktivita GPX byla pozorována při stárnutí oocytů u lína obecného, která by mohla odhalovat její významou roli v celkovém poklesu kvality jiker. Zmíněná snížená aktivita GPX nebyla pozorována u oocytů kapra obecného a karase zlatého. Kromě přímých účinků oxidativního stresu na oocyty by mohly jejich funkčnost ovlivnit i změny kompozice mastných kyselin a lipidů, které jsou způsobené oxidací. Pozorovali jsme, že při stárnutí oocytů se nemění složení mastných kyselin a skupin lipidů v oocytech. Proto podle našich získaných výsledků není oxidativní stres hlavním iniciátorem nebo promotorem procesu stárnutí oocytů. Avšak komplementární testy a analýzy jsou potřebné k jasnému vysvětlení jeho vlivu a zapojení do celého procesu stárnutí oocytů. Zvýšené hladiny mRNA apoptoticky souvisejících transkriptů během stárnutí oocytů v této práci demonstrují, že apoptotická dráha může být zapojena do molekulárních změn během stárnutí oocytů. Studium epigenetických změn spojených se stárnutím rybích oocytů se jeví jako velmi zajímavý výzkumný

Abstract:

In fish, delayed spawning in nature, delayed egg collection in capture and delayed fertilization after egg stripping lead to excessive oocyte ageing and finally over-ripening. Until now there has been only poor understanding about the processes and underlying mechanism of oocyte ageing in fish as well as other vertebrates. Some studies on other vertebrates have suggested the oxidative stress as initiating factor for the progress of oocyte ageing. The present work investigated possible changes in the mRNA levels of transcripts involved in oxidative damage, mitochondrial function and stress response, with roles in fertilization, embryo development, transcriptional regulation and cell cycling as well as the ones related to the apoptosis during the egg over-ripening. This study investigated the oxidation status of oocytes during post-ovulatory ageing by measuring TBARs as the marker of lipid oxidation and carbonyls which shows the extension of protein oxidation. In addition the role of oxidative stress in the progress of oocyte ageing was assessed by evaluation the activity of antioxidant enzymes, CAT, SOD, GPX and GR. Possible changes in lipid class and fatty acid composition during fish oocyte aging were also examined. Egg viability parameters and larval ploidy levels were examined. Complete loss of egg viability for African catfish (Clarias gariepinus) occurred at 16 and 24 Hours Post Stripping (HPS) when eggs were stored at 25°C and 4°C respectively. Under both storage temperatures, the embryo mortality and larval malformation rates increased significantly over time and were the highest in the most aged oocytes. We determined the time in which the eggs retain their fertilizing ability 10 hours for tench (Tinca tinca) at 20 °C, 18 hours for goldfish (Carassius auratus) at 20 °C and 14 hours Post Ovulation (HPO) and more than 10 Hours Post Stripping (HPS) for common carp (Cyprinus carpio) at 20 °C. Our results demonstrated no significant changes in the mRNA levels of oxidative stress related genes and genes involved in cell cycling during the progress of oocyte ageing in any of species; African catfish, goldfish and common carp. Additionally, with elapsing time following ovulation the amount of TBARs and carbonyls, did not change in any of the oocytes from our experimented species; African catfish, tench, goldfish and common carp. However an increase in the mRNA abundance of apoptotic related genes were observed. Antioxidant enzyme analysis indicated no significant changes in the activity of CAT and SOD during post-ovulatory ageing of common carp, goldfish and tench oocytes. However, a significant decrease in the activity of GPX was observed during post-ovulatory ageing of tench oocytes which could play a major role in the overall drop of egg quality. This observation in GPX activity was not observed in common carp and goldfish oocytes. Besides the direct effects of oxidative stress on oocytes, also changes of fatty acid and lipid composition caused by oxidation could affect the functionality. We observed that post-ovulatory ageing of the oocytes does not change the fatty acids and lipid class composition of the oocytes. Therefore, according to our obtained results, oxidative stress is not the main initiator or promotor of the oocyte ageing process. However, complementary tests and analysis are required to clearly clarify its involvement. Increased mRNA levels of apoptotic related transcripts during oocyte ageing in this study demonstrates that apoptotic pathway might be involved in the molecular changes during the progress of oocyte ageing. Investigation of epigenetic changes associated with fish oocyte ageing seems to be interesting for future research works.

Abstract:

směr pro budoucí vědecké studie.

Keywords

stárnutí rybích oocytů, oxidativní stress, množství mRNA, antioxidační enzymy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 9. 2018

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery