Detekce spermadhesinu AWN v ejakulátu hřebců

Bc. Lucie Beranová

Master's thesis

Detection of spermadhesin AWN in stallion ejaculate

Anotácia:

Ejakulát hřebce je tvořen dvěma složkami a to buněčné a tekuté. Buněčnou složku představují spermie, které nesou genetickou informaci jedince a mají za úkol proniknout do oocytu. Jsou složené z hlavičky, krčku a bičíku. Celý povrch spermie je pokryt plasmatickou membránou, pod kterou se na vrcholu hlavičky nachází akrozom. Akrozom je tvořen vnější a vnitřní membránou a mezi nimi jsou enzymy zajišťující akrozomální reakci, nutnou pro spojení oocytu se spermií. Spojovací část bičíku obsahuje 60 mitochondrií, které zajištují energii pro pohyb bičíku. Pohyb také zajištuje uspořádání mikrotubulů v bičíku. Tekutou složku ejakulátu tvoří semenná plazma, která má za úkol zajistit výživu, transport a ochranu spermií při průchodu samčím i samičím reprodukčním traktem. Také dodává spermiím látky nutné pro zajištění úspěšné fertilizace. Semenná plazma je produkována nadvarlaty a přídatnými pohlavními žlázami, které u hřebce nalezneme v plném počtu (ampule chámovodu, semenné váčky, prostata, bulbouretrální žlázy). Jedná se o tekutinu tvořenou směsí bílkovin, iontů, volných aminokyselin, sacharidů, lipidů, polyaminů, prostaglandinů a steroidních hormonů. Zásadní roli v semenné plazmě mají proteiny. Díky svým vazebným vlastnostem se významně zapojují do fertilizačního procesu a zajišťují nezbytné kroky vedoucí k úspěšnému oplození oocytu. Proteiny semenné plazmy jsou děleny do tří základních skupin: Fn-2, CRISP a spermadhesiny. Do Fn-2 skupiny patří nejvíce zastoupené proteiny v hřebčí semenné plazmě a to proteiny HSP-1 a HSP-2. Tato práce se blíže zaměřuje na proteinovou skupinu spermadhesinů a konkrétně protein HSP-7. Tento hřebčí protein je homologní s kančím spermadhesinem AWN. Liší se od sebe ve svém uspořádání pouze třemi aminokyselinami a také lokalizací na spermiích. Kančí protein AWN je lokalizován po celé akrozomální čepičce, kdežto u hřebců je protein lokalizován v ekvatoriálním segmentu hlavičky spermie. Tato skutečnost byla praktickou částí práce potvrzena s využitím detekce proteinu na hřebčích spermiích pomocí protilátky proti kančímu AWN imunofluorescenční mikroskopií. Následně byla dále přítomnost a kvantifikace proteinu AWN hodnocena imunodetekcí jak na vzorcích hřebčích spermií, tak v semenné plazmě. Z výsledků imunofluorescenční mikroskopie vyplývá jasná lokalizace spermadhesinu v ekvatoriálním segmentu hřebčích spermií, ovšem je zde patrná variabilita množství detekovaného proteinu mezi jednotlivými hřebci. Spermií bez detekovaného proteinu bylo více u vzorků, které prošly krokonzervací, v porovnání s nativními vzorky, avšak tyto rozdíly nebyly statisticky významné. Mezi jednotlivými kategoriemi spermií, byla také prokázána korelace mezi kategorií spermií se signálem protilátky proti AWN a zároveň funkčním akrozomem a mezi kategorií spermií s pozitivním signálem protilátky proti AWN a bez funkčního akrozomu. Z výsledků imunodetekce je patrný rozdíl mezi množstvím proteinů získaných ze spermií a ze semenné plazmy. U jednotlivého hřebce, u kterého bylo detekováno velké množství proteinu AWN v semenné plazmě bylo zaznamenáno zároveň úměrně nižší množství detekované na spermiích a opačně.

Abstract:

The ejaculate of the stallion consists of two components, cellular and liquid. The cellular component is sperm, which carry the genetic information of an individual and have the task of penetrating the oocyte. They consist of a head, neck, and a flagellum. The entire surface of the sperm is covered with a plasma membrane, under which there is an acrosome at the top of the head. The acrosome is made up of an outer and an inner membrane, and between them are enzymes that provide the acrosomal reaction needed to connect the oocyte with the sperm. The connecting part of the flagellum contains 60 mitochondria, which provide energy for the movement of the flagellum. The movement also ensures the arrangement of the microtubules in the flagellum. The liquid component of ejaculate consists of seminal plasma, which has the task of providing nutrition, transport, and protection of sperm during passage through the male and female reproductive tracts. It also supplies sperm with the substances necessary to ensure successful fertilization. Seminal plasma is produced by the epididymis and accessory gonads, which can be found in the stallion in full numbers (ampoules of the vas deferens, seminal vesicles, prostate, bulbourethral glands). It is a fluid made up of a mixture of proteins, ions, free amino acids, carbohydrates, lipids, polyamines, prostaglandins, and steroid hormones. Proteins play a crucial role in seminal plasma. Thanks to their binding properties, they are significantly involved in the fertilization process and provide the necessary steps leading to successful fertilization of the oocyte. Seminal plasma proteins are divided into three basic groups: Fn-2, CRISP and spermadhesins. The Fn-2 group includes the most abundant proteins in stallion seminal plasma, namely the HSP-1 and HSP-2 proteins. This work focuses on the protein group of spermadhesins, more specifically the HSP-7 protein. This stallion protein is homologous to the boar spermadhesin AWN. They differ in their arrangement only by three amino acids and, also by their localization on sperm. Boar AWN protein is located throughout the acrosomal cap, whereas in stallions the protein is in the equatorial segment of the sperm head. This fact was confirmed by the practical part of the work using the detection of protein in stallion sperm using anti-boar antibody AWN by immunofluorescence microscopy. Subsequently, the presence and quantification of AWN protein was further evaluated by immunodetection on both stallion sperm and seminal plasma samples. The results of immunofluorescence microscopy show a clear localization of spermadhesin in the equatorial segment of stallion sperm, but there is a noticeable variability in the amount of detected protein between individual stallions. There was more sperm without a detected protein in the samples that underwent cryo-conservation compared to the native samples, but these differences were not statistically significant. Between the categories of sperm, a correlation was also demonstrated between the category of sperm with an anti-AWN antibody signal and a functional acrosome and between the category of sperm with a positive anti-AWN signal and without a functional acrosome. The results of immunodetection show a difference between the number of proteins obtained from sperm and from seminal plasma. In an individual stallion in which a large amount of AWN protein was detected in seminal plasma, a proportionally lower amount detected in sperm was recorded at the same time, and vice versa.

Kľúčové slová

spermie, spermadhesiny, proteiny, ejakulát, hřebec

Keywords

spermadhesins, proteins, ejaculate, stallion, sperm

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 4. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: Ing. Filipa Bubeníčková, Ph.D.
• Oponent: Jana Jankovičová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / odbor:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology