Vývoj fluorescenčních substrátů pro enzymologii

Bc. Veronika Dočkalová

Master's thesis

Development of fluorescent substrates for enzymology

Anotácia:

Enzymy jsou biologické makromolekuly, které katalyzují chemické reakce včetně většiny metabolických procesů. Detailní studium kinetiky enzymových reakcí je proto důležitým krokem pro pochopení mechanismu těchto procesů a případné využití enzymů v průmyslu nebo při vývoji léčiv. Jednou z metod umožňující monitorování enzymové reakce je nahrazení přirozeného substrátu jeho fluorescenčním analogem, který v průběhu reakce mění své spektrální vlastnosti, a poskytuje tak přímou informaci o katalytickém cyklu. Tato diplomová práce je zaměřená na uplatnění fluorescenčních substrátů při studiu kinetiky reakcí enzymů ze skupiny haloalkandehalogenas. Na základě testování aktivity vybraných enzymů s fluorescenčním substrátem byly identifikovány dva nejaktivnější zástupci DmmA a LinB, kteří byli podrobeni detailnější kinetické charakterizaci. Výsledky měření časově ustálené kinetiky překvapivě ukázaly, že objemný fluorescenční substrát je jeden z nejlepších dosud rozpoznaných substrát pro oba testované enzymy. Měření tranzitní kinetiky demonstrovalo vysokou citlivost fluorescenčních substrátů a jejich schopnost specificky monitorovat jednotlivé reakční kroky včetně konformačních změn enzymu. Na závěr byly fluorescenční substráty uplatněny při měření enzymové kinetiky na mikrofluidním čipu, který umožňuje rychlý sběr komplexních kinetických a termodynamických dat s minimálním nárokem na množství vzorku.

Abstract:

Enzymes are biological macromolecules that catalyze chemical reactions including most of the metabolic processes. The detailed study of the kinetics of enzyme reaction is a crucial step for understanding the mechanism of these processes and potential application of enzymes in industry or drug development. One of the methods enabling to monitor enzyme reaction is the replacement of the natural substrate by its fluorescent analogue which changes its spectral properties during the reaction and thus, it provides a direct readout of enzymatic turnovers. This Diploma Thesis is focused on the application of fluorescent substrates in the kinetic study of enzymes from haloalkane dehalogenase family. Based on the activity screening of selected enzymes with the fluorescent substrate, two the most active catalyst, DmmA and LinB, were identified and engaged in detailed kinetic characterization. Interestingly, the results of steady-state kinetics revealed that the bulky fluorescent substrate is one of the best substrates reported so far for both tested enzymes. The measurement of transient-state kinetics demonstrated high sensitivity of fluorescent substrates and their ability to specifically monitor individual reaction steps including conformation changes of the enzyme. Moreover, fluorescent substrates were applied in a measurement of enzyme kinetics on a microfluidic chip, which allows a rapid collection of complex kinetic and thermodynamic data with minimal sample consumption.

Keywords

Fluorescence, enzym, fluorescenční substrát, enzymová kinetika, techniky na úrovni jedné molekuly, mikrofluidika, halogenalkandehalogenázy, enzyme, fluorescent substrate, enzyme kinetics, single-molecule techniques, microfluidics, haloalkane dehalogenases

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 6. 2018
• Vedúci: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Physics / Biophysics