Genetická, biochemická a mikroskopická analýza regulace FSD1 pomocí SPL1 u Arabidopsis

Bc. Adam ZEINER

Master's thesis

Genetic, biochemical and microscopic analysis of FSD1 regulation by SPL1 in Arabidopsis

Abstract:

SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE 1 (SPL1) je členem rodiny transkripčních faktorů, které jsou specifické pro rostliny. Tyto proteiny regulují rostlinný vývoj a odpověď na odlišné podněty. SPL7, blízký protein SPL1, reguluje expresi některých isoforem SUPEROXIDDISMUTAS (SOD). Dříve provedené bioinformatické analýzy umožňují uvažovat SPL1 jako transkripční faktor s potenciálem regulovat SOD. SOD jsou hlavní součástí buněčné obrany vůči oxidačnímu stresu a jsou regulovány mitogen aktivovanými protein kinasami (MAPK). MAPK hrají klíčovou signalizační roli v procesech odpovědi na různé biotické a abiotické podněty a v rostlinném vývoji. Cílem teoretické části této práce bylo shrnout dosavadní znalosti o SPL, SOD a MAPK. Experimentální část je zaměřena na charakterizaci SPL1 a jeho genetickou interakci s MPK3 a MPK6. První část odhaluje nové potenciální SPL-regulované geny, jejichž genové produkty byly dříve ukázány jako proteiny spojené s FeSOD1 (FSD1) anebo MAPK. Dále byli připraveni dvojití mutanti spl1.1/mpk3.1 a spl1.1/mpk6.2. Tito mutanti byli ověřeni pomocí genotypování a mohou sloužit k objasnění genetické interakce SPL1 a MPK3, nebo MPK6. Fenotypové a biochemické analýzy spl1 mutantů odhalily potenciální význam SPL1 jako pozitivního regulátoru prodlužování primárního kořene, signalizace kyseliny abscisové a aktivity MnSOD1 (MSD1). SPL1 negativně reguluje prodlužování prýtu a kvetení. V rámci druhé části práce byly připraveny fúzní konstrukty eGFP:SPL1 a byla provedena jejich tranzientní exprese v listech Nicotiana benthamiana pro pozorování pomocí konfokální laserové skenovací mikroskopie. Signál eGFP-SPL1 pod kontrolou nativního promotoru byl lokalizován v jádře a v plasmodesmatech. Nadexpresní konstrukt poskytnul informace o specifické subcelulární lokalizaci v endoplasmatickém retikulu a pravděpodobně v jeho globulárních strukturách. Oba konstrukty byly použity pro stabilní transformaci rostlin Arabidopsis thaliana. Byly získány pouze rostliny nesoucí konstrukt pSPL1::eGFP:SPL1. Poslední část je věnována hodnocení homodimerizace SPL1 pomocí kvasinkového dvouhybridního systému. Výsledky ukázaly autoaktivaci reportérového genu, což znemožnilo hodnocení homodimerizace. Dále byly připraveny konstrukty pro bimolekulární fluorescenční komplementaci pro budoucí potvrzení SPL1 protein-proteinových interakcí. SPL1 se slibně jeví jako MAPK-regulovaný protein, který má potenciál regulace antioxidační obrany a rostlinného vývoje.

Abstract:

SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE 1 (SPL1) is a member of plant-specific family of transcription factors which regulate plant development and response to various stimuli. SPL7, protein closely related to SPL1, regulates the expression of some SUPEROXIDDISMUTASE (SOD) isoforms. Based on previous bioinformatic analyses, SPL1 is suggested as transcription factor potentially regulating SOD. SOD are major components of plant antioxidant defence which are subjected to regulation by mitogen activated protein kinases (MAPK). MAPK are also key signalling components involved in response to diverse biotic and abiotic stimuli and plant development. Therefore, the theoretical part of the thesis summarizes the current knowledge on SPL, SOD and MAPK. Experimental part is focused on the characterisation of SPL1 and its genetic interaction with MPK3 and MPK6. Within the first part, new potential SPL-regulated genes were predicted out of genes encoding proteins previously found to be connected to FeSOD1 (FSD1) or MAPK. Next, Arabidopsis thaliana double mutants spl1.1/mpk3.1 and spl1.1/mpk6.2 were prepared and validated using genotyping. They will help to elucidate the genetic interaction between SPL1 and MPK3 or MPK6. Moreover, phenotypic and biochemical analysis of spl1 mutants uncovered potential importance of SPL1 as positive regulator of primary root elongation, and abscisic acid signalling, as well as MnSOD1 (MSD1) activity. SPL1 negatively regulates shoot elongation and flowering. Within the second part, eGFP:SPL1 fusion constructs have been prepared and transiently expressed in Nicotiana benthamiana leaves for confocal laser scanning microscopic observations. Signal of eGFP-SPL1 under the control of native promotor was localized in nucleus and plasmodesmata. Moreover, overexpression construct showed specific subcellular localization in endoplasmic reticulum and most likely endoplasmic reticulum aggregates. Both constructs were used for stable transformation of Arabidopsis thaliana plants. Only plants harbouring the construct pSPL1::eGFP:SPL1 were obtained. Within the last part, possible homodimerization of SPL1 was tested using yeast two hybrid system. The results showed autoactivation of the reporter gene which hindered the evaluation of the homodimerization. In addition, constructs for bimolecular fluorescence complementation assay were prepared for future validation of SPL1 protein-protein interactions. In conclusion, SPL1 appears as a promising protein regulated by MAPK with potential impact on antioxidant defence and plant development.

Keywords

SPL1, FSD1, MPK3, MPK6, signalizace, kvetení, superoxiddismutasy, Arabidopsis thaliana, MAP kinasy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology