Komparativní genomika Treponema pallidum: cesta od určení sekvence chromozomu k aplikacím v klinické diagnostice

Mgr. Petra Pospíšilová, Ph.D.

Disertační práce

Comparative genomics of Treponema pallidum: from whole genome sequencing to diagnostic applications

Anotace:

Druh Treponema pallidum zahrnuje 3 pro člověka patogenní poddruhy. Tyto poddruhy – pallidum, pertenue a endemicum – způsobují přes velice blízkou sekvenční příbuznost onemocnění s odlišnou klinickou manifestací. Jedná se o syfilis, yaws a endemickou syfilis. Patogenní treponemata zahrnují ovšem i patogeny jiných hostitelů než člověka. Jedná se o druhově nezařazený opičí izolát Fribourg-Blanc a druh T. paraluiscuniculi. Kmen Fribourg Blanc způsobuje u opic onemocnění podobné treponematóze yaws a druh T. paraluiscuniculi je původcem venerické spirochetózy králíků. Jmenované patogeny nelze morfologicky ani serologicky odlišit a jejich genomy vykazují nezvykle vysokou sekvenční identitu (99 a víc %). V současné době je známo velmi málo o genetické variabilitě na úrovni srovnání celých genomů popsané skupiny treponemat. Metoda komparativního genomového sekvenování byla použita pro určení sekvence chromozomu Treponema pallidum subsp. pallidum kmene SS14. K vyhledání sekvenčně divergentních oblastí genomu mezi kmeny Nichols a SS14 bylo využito hybridizace genomové DNA k čipu, který obsahoval oligonukleotidy pokrývající chromozomální sekvenci Treponema pallidum ssp. pallidum kmene Nichols. Poté byly navrženy oligonukleotidy sekvenačního čipu, který byl použit pro odhalení konkrétních jednonukleotidových záměn u kmene SS14. Tyto výsledky v kombinaci s výsledky sekvenovaní dle Sangera a fyzikálního mapování vedly k získání kompletní sekvence chromozomu T. pallidum kmene SS14. Celkem bylo v genomu kmene SS14 identifikováno 327 jednonukleotiových záměn (SNP), 14 delecí a 18 inzercí. 310 SNP, 12 delecí a 13 inzercí bylo lokalizováno v kódujících sekvencích a představují sekvenční změny, které vedou ve 4 případech ke genovým fúzím, v 5 případech k posunům čtecího rámce, k 1 nesmyslné mutaci, k 1 mutaci ve stop kodonu. Ve 33 případech došlo ke konzervativní záměně aminokyseliny a ve 188 případech k záměně nekonzervativní. 64 % SNP se nacházelo v hypotetických genech a analýza proteinů ukázala, že k 67 % záměn aminokyselin dochází v proteinech s neznámou funkcí. Metoda CGS byla použita pro určení sekvenčně divergentních míst v genomech T. pallidum subsp. pertenue kmene Samoa D a T. paraluiscuniculi kmene Cunuculi A. Nalezené sekvečně divergentní oblasti genomu kmene Samoa D byly podrobeny sekvenování Sangerovou metodou. Rozsáhlé zkušenost s navrhováním primerů pro PCR amplifikace v rámci genomu T. pallidum v budoucnosti urychlí projekty srovnání několika treponemálních genomů a poskytnou tak zázemí pro identifikaci lokusů vhodných pro skrínink klinických izolátů jednotlivých poddruhů. Na obecnější úrovni pomůže komparativní genomika nahlédnout do tajů patogeneze treponemálních onemocnění. Na základě akumulujících se dat chromozomálních sekvencí různých kmenů byly vybrány čtyři lokusy a podrobeny sekvenční analýze u 18 typových kmenů. Byly zjištěny nukleotidové sekvence genů TP0136, TP0326, TP0488 a TP0548 a porovnány v kontextu 5 skupin typových kmenů. Typové kmeny zahrnovaly 9 kmenů poddruhu pallidum, 5 kmenů poddruhu pertenue, 2 kmeny poddruhu endemicum, 1 blíže nespecifikovaný opičí izolát (Fribourg-Blanc) a 1 kmen T. paralusicuniculi (Cuniculi A). Těchto 5 kategorií kmenů tvoří u lokusů TP0136 a TP0548 jasně oddělené skupiny, přičemž poddruh pallidum se dělí na dvě skupiny kmenů – Nichols a jemu podobné kmeny a SS14 a jemu podobné kmeny. Sekvence kmene Mexico A byla výjimkou z tohoto schématu u lokusů TP0326 i TP0488. U lokusu TP0326 je sekvence kmene Mexico A mozaikou variant charakteristických pro syfilitické kmeny patřících do skupiny Nichols a jemu podobné a kmeny poddruhu pertenue. U lokusu TP0488 je sekvence kmene Mexico A mozaikou variant charakteristickýc

Anotace:

h pro poddruh pallidum, pertenue a endemicum. Konsenzuální nukleotidové sekvence čtyř lokusů byly použity pro rekonstrukci fylogenetického stromu. Fylogenetická analýza potvrdila opodstatnění rozdělení patogenních treponemat na jednotlivé druhy a poddruhy. Nepřinesla ovšem zásadní vhled do dlouhodobé debaty o původu venerické syfilis. Srovnání genomů kmenů Nichols a SS14 odhalilo sekvenčně divergentní místa, která jsou vhodná pro molekulární typování klinických izolátů u pacientů se syfilis. Jelikož nelze bakterii T. pallidum kultivovat v podmínkách in vitro, představuje molekulární detekce treponemální DNA jedinou metodu pro typování treponemat. Stejným způsobem lze testovat u izolátů T. pallidum rezistenci k makrolidům. Cílem bylo otestovat lokusy TP0136 a TP0538 a zjistit frekvenci výskytu mutace způsobující rezistenci k makrolidům u klinických vzorků v ČR. Primární detekce genetického materiálu T. pallidum u klinických vzorků zahrnovala dvoukrokovou PCR dvou nezávislých treponemálních lokusů (tmpC, polA). U pozitivních vzorků byly dále amplifikovány lokusy TP0136 a TP0548 a úsek 23S rDNA zahrnující pozici 2058. Dva amplikony byly sekvenovány dideoxynukleotidterminátorovou metodou. Amplikon 23S rDNA byl podroben restrikční analýze s cílem potvrdit nebo vyloučit přítomnost mutace A2058G. V letech 2005-2008 bylo shromážděno 51 PCR pozitivních klinických vzorků od 37 pacientů z různých regionů České republiky. Pokud bylo získáno více vzorků od téhož pacienta, výsledné sekvence pro testované lokusy se shodovaly. U 26 pacientů byly vyšetřené klinické vzorky ve sledovaných lokusech sekvenčně identické se sekvencí kmene SS14. U 6 pacientů došlo k záchytu materiálu sekvenčně unikátního, tedy odlišného od dostupných typových kmenů (2 z nich navzájem totožné). U pěti pacientů se nepodařilo získat amplikony, nebo se je nepodařilo sekvenovat. U 22 pacientů (59,5 %) byl diagnostikován kmen citlivý k makrolidům. Osm pacientů (21,6 %) bylo infikováno kmenem, který v genu pro 23S rRNA nesl mutaci A2058G. U sedmi dalších pacientů (18,9 %) byl zjištěn výskyt kmene se záměnou A na G v pozici 2059, která nebyla dosud popsána. U jednoho z těchto pacientů bylo zaznamenáno selhání léčby makrolidovým preparátem obsahujícím spiramycin. Naše výsledky ukázaly, že klinické izoláty T. pallidum ze středoevropské země jsou identické nebo velmi podobné kmenu SS14. Typovací systém zahrnující lokusy TP0136, TP0548 a lokus rezistence k makrolidům byl schopen odlišit 8 subtypů mezi 32 klinickými izoláty, a proto je možno ho považovat za slibnou metodu pro charakterizaci izolátů z klinického materiálu. Získané výsledky dále naznačují, že geneticky kódovaná rezistence k makrolidům je u syfilis v České republice relativně častá (40,5 %) a pravděpodobně jde o důsledek častého podávání antibiotik této skupiny při léčbě jiných infekcí.

Abstract:

Genus Treponema includes several pathogenic spirochetes. Three human pathogens include: Treponema pallidum ssp. pallidum, the causative agent of venereal syphilis; T. pallidum ssp. pertenue, the causative agent of yaws; and T. pallidum ssp. endemicum causing endemic syphilis. Non-human pathogens include: unclassified simian isolate Fribourg-Blanc and T. paraluiscuniculi. Fribourg-Blanc strain causes infections similiar to yaws in primates and T. paraluiscuniculi causes venereal spirochetosis in rabbits. All these pathogenic agents are morphologically and serologically indistinguishable and their genomes show unusual degree of sequence similarity (99% or higher identity). In fact, very little is known about the genetic differences on the whole genome scale in the group of pathogenic treponemes. Comparative genome sequencing strategy (CGS) was employed to sequence the bacterium Treponema pallidum ssp. pallidum strain SS14. Genomic DNA hybridization to a dense oligonucleotide tiling array based on sequence of Treponema pallidum ssp. pallidum strain Nichols discovered regions of different sequence in SS14. Sequencing array designed to reveal single nucleotide changes in combination with dideoxy-terminator (DDT) sequencing of divergent regions and whole genome fingerprinting (WGF) analysis was used to finish the genome sequence of SS14 strain. Altogether 327 SNPs, 14 deletions and 18 insertions were found. 310 SNPs, 12 deletions and 13 insertions represented changes in coding sequences and led to 4 gene fusions, 5 frameshifts, 1 nonsense mutation, 1 read through stop codon mutation, 33 conservative aa changes and 188 non-conservative aa changes. 64% of SNPs affected hypothetical genes and protein analysis showed that 67% of all amino acid changes were in proteins with unknown function. CGS was also applied to determine divergent loci in the genomes of T. pallidum ssp. pertenue strain Samoa D and in T. paraluiscuniculi strain Cunuculi A. Discovered divergent loci in the Samoa D genome were sequenced by DDT sequencing. Extensive experience with PCR primer design throughout T. pallidum genome will speed up future multiple T. pallidum strain genome comparison projects and will provide a broad background for mapping of candidate loci for screening of clinical isolates of individual subspecies. On more general basis, comparative genomics of T. pallidum will contribute to a closer insight in pathogenesis of treponemal diseases. Based on the accumulating sequence data of various treponemal genomes, four loci were chosen for analysis in available treponemal strains. Nucleotide and protein sequences of genes TP0136, TP0326, TP0488 and TP0548 were determined and compared in 5 categories of Treponema sp. strains: in subspecies pallidum (9 strains causing syphilis), in subspecies pertenue (5 strains causing yaws), in subspecies endemicum (2 strains causing endemic syphilis), in 1 strain of unclassified simian isolate (Fribourg-Blanc) and in 1 strain of T. paraluiscuniculi (Cuniculi A). The TP0136 and TP0548 analyzed loci showed discrete clusters in 5 groups of type strains. Analysis of strains belonging to ssp. pallidum revealed two distinct subclusters containing Nichols-like and SS14-like sequences, respectively. Mexico A strain was the exception from this situation in TP0326 and TP0488 loci. The TP0326 locus in Mexico A strain was shown to be a mosaic of sequence changes characteristic for Nichols-like syphilitic strains and yaws strains. The TP0488 locus in Mexico A strain represents a mosaic of molecular signatures characteristic for ssp. pallidum, pertenue and endemicum. Consensus nucleotide sequences were used to infer the phylogeny of treponemal species and subspecies. Phylogenic analysis showed that 3 subspecies of T. pallidum are legitimately classified as distinct entities. However, it brought no major insights into the long debate about the origin of venereal syphilis. Whole genome comparisons of the Nichols and SS14 sequences revea

Abstract:

led divergent loci that can be used for molecular typing of syphilitic clinical isolates. As T. pallidum can not be cultured in vitro, molecular detection of syphilitic treponemes represents the only available method for treponeme typing. In addition, macrolide antibiotic resistance in clinical isolates can be tested. Our aim was to screen divergent loci of the T. pallidum genomes and to assess the incidence of macrolide causing mutations among clinical isolates in the Czech Republic. Primary screening of clinical specimens was performed using nested PCR detection of two T. pallidum specific loci (tmpC, polA). In PCR positive samples, direct Sanger sequencing of TP0136 and TP0548 PCR products was used to determine the corresponding sequences. Amplicon of 23S rDNA locus was subjected to restriction digest test to reveal the presence of A2058G mutation. The set of 51 clinical isolates with detectable treponemal DNA was collected from 37 patients in the Czech Republic in the time period 2005-2009. There was complete concordance of detected sequences in multiple samples collected from the same patient. Sequences in TP0136 and TP0548 loci were either identical with (in 26 patients) or very similar to (in 6 patients) corresponding sequences in the SS14 strain. No strain showed the molecular signatures of the Nichols strain in these loci. These sequences were not available in 5 patients (the amplicon was not obtained or sequencing was not successful). 22 patients (59.5%) were infected with macrolide sensitive strains of T. pallidum. Eight patients (21.6%) were diagnosed with strains bearing the A2058G transition and seven patients (18.9%) with strains bearing the novel A2059G mutation (macrolide treatment failure was reported in one of these patients). Our results showed that clinical isolates in the Central European country were identical or closely related to the SS14 strain. Novel mutations were also detected in these loci that discriminated 8 types among 32 typeable syphilitic strains. Presented results showed that TP0136 and TP0548 loci combined with macrolide resistence locus represent promising targets for molecular typing of clinical isolates of T. pallidum. Macrolide resistant isolates of T. pallidum bearing A2058G and A2059G mutations are relatively abundant in the Czech Republic (40.5%), possibly as a result of frequent administration of these antibiotics to treat various infections.

Klíčová slova

Treponema pallidum, syfilis, yaws, komparativní genomika, klinická diagnostika, syphilis, comparative genomics, clinical diagnostics

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 11. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 18. 12. 2009
• Vedoucí: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.

Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská biologie (čtyřleté) / Lékařská biologie