3D kultivační systém využívající GrowDex pro kultivaci kumulo-oocytárních komplexů prasete

Bc. Tereza Šmídová

Master's thesis

3D culture system with GrowDex for cumulus-oocytes complexes cultivation

Abstract:

Kultivační systémy využívající trojrozměrné (3D) prostředí představují pokročilý přístup v buněčné kultivaci, jelikož lépe odrážejí přirozené prostředí buněk a podporují jejich vývoj. Cílem diplomové práce bylo srovnat 3D kultivační systém pro dlouhodobou kultivaci oocyty obklopujících buněk prasete využívající celulózový hydrogel GrowDex se standardním 2D kultivačním prostředím z pohledu exprese vybraných markerů apoptózy. Ve 3D kultivačním prostředí s přídavkem hydrogelu GrowDex v různé koncentraci (1 a 0,5 %) bylo nejprve hodnoceno jaderné zrání kumulo-oocytárních komplexů (COCs) prasete. Oocyty kultivované v kultivačním médiu M199 s přídavkem hydrogelu GrowDex (3D) v obou použitých koncentracích vykazovaly srovnatelné výsledky jaderného zrání s kontrolou (2D). Kumulární buňky z oocytů ve stádiu druhé meiotické metafáze byly poté ve 3D a standardním kultivačním prostředí (2D) ponechány k dlouhodobé kultivaci po dobu 2, 4, 7 a 16 dní. Na základě exprese markerů apoptózy byl hodnocen vitální stav kultivovaných buněk. Markery apoptózy byly zjišťovány pomocí imunodetekce metodou Western blot. Hodnocena byla míra exprese anti-apoptotického proteinu Bcl-2 a pro-apoptotického proteinu Bax z rodiny proteinů Bcl-2, jejíž členové jsou schopní regulovat propustnost mitochondriální membrány pro cytochrom c a jsou zásadní pro celý proces vnitřní apoptotické dráhy. Síla signálu reakce proteinu s protilátkou na membráně byla hodnocena na základě parametru integrované optické denzity (IOD), která se rovná součinu průměrné optické denzity a plochy, kde proběhla reakce proteinu s protilátkou. Stanovené hodnoty byly následně vztaženy k IOD referenčního proteinu tubulinu, který se vyskytuje ve všech typech buněk a takto byla získána relativní integrovaná optická denzita (RIOD). Proteiny Bcl-2 i Bax byly pomocí imunodetekce nalezeny ve všech kategoriích dlouhodobě kultivovaných buněk. Míra exprese proteinů ze skupiny Bcl-2 v kumulárních buňkách byla hodnocena po různé době kultivace, a to jak z 2D, tak z 3D kultivačního prostředí s přídavkem hydrogelu GrowDex. Hypotéza, že ve 3D kultivačním systému bude vyšší exprese anti-apoptotického proteinu, a naopak nižší exprese pro-apoptotického proteinu nebyla potvrzena. Anti-apoptotický protein Bcl-2 nevykazoval statisticky významou vyšší míru exprese ve 3D systému s GrowDex oproti 2D prostředí. Jediný významný rozdíl byl zjištěn v délce kultivace do 16 dní. Ani předpokládaná nižší exprese pro-apoptotického proteinu Bax ve 3D systému s GrowDex nebyla statisticky prokázána, a to v žádné z kategorií hodnocených kumulárních buněk. Z pohledu exprese markerů apoptózy i výsledků jaderného zrání jsou oba kultivační systémy srovnatelné. V budoucích experimentech by bylo vhodné zaměřit se na další 3D kultivační systémy a detekci nových markerů, jako jsou markery proliferace a diferenciace.

Abstract:

Culture systems using three-dimensional (3D) environment represent an advanced approach in cell culture, as they better reflect the natural environment of cells and support their development. The aim of the diploma thesis was to compare a 3D culture system for long-term cultivation of porcine oocyte-surrounding cells using cellulose hydrogel GrowDex with a standard 2D culture medium in terms of expression of selected markers of apoptosis. Nuclear maturation of cumulus-oocytes complexes (COCs) in a 3D culture medium with the addition of GrowDex hydrogel at various concentrations (1 and 0.5%) was first evaluated. Oocytes cultured in M199 culture medium supplemented with GrowDex hydrogel (3D) at all used concentrations showed comparable nuclear maturation results to the control (2D). Cumulus cells from the oocytes in the second meiotic metaphase stage were then left in long-term culture in 3D and standard culture medium (2D) for 2, 4, 7 and 16 days. Based on the expression of markers of apoptosis, the vital status of cultured cells was assessed. Markers of apoptosis were detected by Western blot immunodetection. The expression levels of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and the pro-apoptotic protein Bax from the Bcl-2 family of proteins, whose members are able to regulate the permeability of the mitochondrial membrane to cytochrome c and are essential for the whole process of the intrinsic apoptotic pathway, were evaluated. The strength of the protein-antibody reaction signal on the membrane was evaluated based on the integrated optical density (IOD) parameter, which is equal to the product of the average optical density and the area where the protein-antibody reacted. The determined values were then related to the IOD of the reference protein tubulin, which occurs in all cell types, and the relative integrated optical density (RIOD) was obtained. Both Bcl-2 and Bax proteins were found by immunodetection in all categories of long-term cultured cells. The level of expression of Bcl-2 family proteins in cumulus cells was evaluated after different cultivation times, both from 2D and 3D culture medium with the addition of GrowDex hydrogel. The hypothesis that in the 3D culture system there will be a higher expression of the anti-apoptotic protein and, conversely, a lower expression of the pro-apoptotic protein was not confirmed. The anti-apoptotic protein Bcl-2 did not show a statistically significant higher expression rate in the 3D system with GrowDex compared to the 2D environment. The only significant difference was found in the length of cultivation up to 16 days. The presumed lower expression of the pro-apoptotic protein Bax in the 3D system with GrowDex was not statistically proven in any of the categories of cumulus cells. From the point of view of the expression of apoptotic markers and the results of nuclear maturation, both culture systems are comparable. In future experiments, it would be possible to focus on other 3D culture systems and detect other markers, such as markers of proliferation and differentiation.

Keywords

prase, kumulo-oocytární komplexy, kultivace, markery apoptózy, 3D systém, detekce proteinů

Keywords

3D system, protein detection, cumulus-oocyte complexes, cultivation, apoptotic markers, pig

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Eva Chmelíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology