Selekce mutantních linií mitogen-aktivované proteinkinasy 3 z A. thaliana připravených pomocí technologie CRISPR/Cas9

Markéta KOŘISTKOVÁ

Bachelor's thesis

Selection of mitogen-activated protein kinase 3 mutant lines prepared by Crispr/CAS9 technology

Abstract:

Mitogen-aktivované proteinkinasy se nachází ve všech eukaryotických buňkách, kde tvoří signální dráhy důležité pro reakci na abiotické a biotické stresy, buněčné dělení, diferenciaci nebo vývoj. Mitogen-aktivovaná proteinkinasa 3 (MPK3) se zapojuje do odpovědi rostlin především na abiotický stres, a to hlavně na stres oxidativní, osmotický, z těžkých kovů nebo z nízkých teplot. Metoda CRISPR/Cas9 patří mezi nejnovější technologie úpravy genomu pomocí programovatelných nukleas. Nukleasa Cas9 je přesně naváděna na místo budoucí mutace ve dvoušroubovici DNA, kde tvoří tzv. dvojité zlomy. Tyto zlomy jsou následně opravovány buněčnými procesy, při kterých může dojít ke vzniku mutace. Hlavními cíli této práce byla selekce mutantních rostlin Arabidopsis thaliana mpk3-5 připravených právě technologií CRISPR/Cas9, dále určení typu mutace pomocí sekvencování a potvrzení nepřítomnosti proteinu MPK3 u této mutantní linie. Při genotypizaci byl identifikován jeden homozygotní mutant, jeden transheterozygotní mutant a velké množství heterozygotních mutantů. U mutantních linií byla dále testována přítomnost transkriptu genu MPK3. Ten byl však nalezen i u homozygotní a transheterozygotní rostliny. Dalším krokem bylo testování přítomnosti proteinu MPK3 u linií mutanta mpk3-5. Bylo ověřeno, že protein MPK3 se u homozygotních a transheterozygotních mutantů nevytváří. Další generace homozygotních a transheterozygotních mutantů byla použita pro zjištění adaptace těchto mutantních linií na působení oxidativního stresu, který byl aplikován ve formě přídavku peroxidu vodíku do kultivačního média. Významné rozdíly mezi rostlinami Col-0 a mpk3-5 v odpovědi na stres však nebyly pozorovány. Jedním z možných důvodů je nízká koncentrace stresoru v médiu.

Abstract:

Mitogen-activated protein kinases are found in all eukaryotic cells, where they form signaling pathways important for response to abiotic and biotic stresses, cell division, differentiation, or development. Mitogen-activated protein kinase 3 (MPK3) is primarily involved in the response of the plant to abiotic stress, mainly to stress oxidative, osmotic, heavy metal stress or stress from low temperatures. The CRISPR/Cas9 method is one of the latest genome manipulation technologies using programmable nucleases. Cas9 nuclease is accurately directed to the site of a future mutation in the double helix of DNA, where it forms so-called double strand breaks (DSBs). These breaks are subsequently repaired by cell processes creating possible mutations. The main goals of this work were selection of Arabidopsis thaliana mutants called mpk3-5 prepared by CRISPR/Cas9 technology, then determining the type of mutation by sequencing and confirmation of absence of MPK3 protein. One homozygous mutant, one transheterozygous mutant and a large number of heterozygous mutants were identified by genotyping. The presence of MPK3 transcript was tested in identified mutant lines. However, the transcript was present in all mutant plants including homozygous and transheterozygous mutants. The next step was to test the presence of the MPK3 protein in the mpk3-5 mutant lines. It has been verified that MPK3 is not produced in homozygous and transheterozygous mutants. A next generation of homozygous and transheterozygous mutants was used to determine the adaptation of these mutant lines to oxidative stress, which was applied as hydrogen peroxide addition to the culture medium. However, significant differences between Col 0 and mpk3-5 plants in response to stress were not observed. One possible reason may be the low concentration of the stressor in the medium.

Keywords

mitogen-aktivované proteinkinasy (MAPK), MPK3, Arabidopsis thaliana, CRISPR/Cas9, oxidativní stres

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Veronika Zapletalová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering