Real Time-PCR - nástroj pro detekci a kvantifikaci mikroorganismů

Bc. Jitka Bakalová

Master's thesis

Real Time-PCR - a Tool for the Detection and Quantification of Microorganisms

Abstract:

Gram negativní bakterie mohou produkovat biogenní amin putrescin např. dekarboxylací aminokyseliny L-ornithinu za katalytického působení enzymu ornithindekarboxylasy, který je kódován genem speF, nebo z L-argininu, který je dekarboxylován za katalýzy enzymem arginindekarboxylasou (kódován genem adiA), za vzniku agmatinu, který je dále metabolizován za vzniku zmíněného putrescinu. Předkládaná práce je zaměřena na sledování vlivu faktorů (změny teploty a pH) na genovou expresi sledovaných genů adiA a speF u zvolené bakterie čeledi Enterobacte-riaceae (E. coli) kultivované v reálných vzorcích nízkotučného mléka a vepřové pomazánky (paštiky). Byla optimalizována metoda izolace bakteriální RNA ze zmíněných reálných vzorků. Dále byly ověřeny funkčnosti primerů a účinnosti reakcí (real time-PCR) pro jednotlivé geny (adiA, speF, gapA /housekeeping gen/) v reálných vzorcích. Bylo potvrzeno, že reakce probíhají s dostatečnou účinností (E = 90 - 110 %) i specifičností. Vyhodnocením genové exprese metodou relativní kvantifikace dle Pfaffla bylo zjiš-těno, že pH je faktorem, který expresi genů adiA i speF zvyšuje ve všech testovaných vzorcích. Ve vzorcích bujonu byl pozorován nárůst exprese obou genů ~ o 25 %; ve vzorku paštiky vzrostla exprese sledovaných genů daleko významněji (~ 5x). Naopak teplota je faktorem, který nejen že tlumí růst bakterií, ale snižuje i expresi obou sledovaných genů (~ o 70 %), tak jak se ukázalo ve vzorku bujonu s přídavkem jednotlivých aminokyselin. Lze konstatovat, že sledované geny adiA a speF jsou geny inducibilní, a že faktory jako jsou teplota, pH či dostupnost jednotlivých substrátů genovou expresi ovlivňují.

Abstract:

Gram negative bacteria can produce biogenic amine putrescine, e.g. by decarboxylation of amino acid L-ornithine by the ornithine decarboxylase enzyme (this enzyme is encoded by the speF gene), or by decarboxylatio of L-arginine by the arginine decarboxy-lase enzyme (this enzyme is encoded by the adiA gene), which leads to generation of agmatine. Agmatine is further converted to putrescin. The thesis concentrates on monitoring of the effect of factors (temperature and pH changes) on gene expression of tested genes adiA and speF possessed by some Enterobac-teriaceae family members (E. coli) cultivated in real samples low-fat milk and pork spread (pate). The method of bacterial RNA isolation was optimized from the real samples mentioned above. Functions of primers and efficacies of reactions (real time-PCR) for ge-nes (adiA, speF, gapA /housekeeping gene/) were verified in the real samples. It was con-firmed that reactions are effective (E = 90 - 110 %) and specific. Using Pfaffl's relative quantification method, it was discovered that pH increases gene expression of adiA and speF in all tested samples. It was observed that gene expressi-on of tested genes increases ~ by 25% in broth containing amino acids; in pate it increases even more (~ 5x). On the contrary, the temperature factor inhibits grow of bacteria and also reduces gene expression of tested genes (~ by 70%), as in broth containing amino acids. It was observed that genes adiA and speF are inducible genes, and factors such as temperature, pH or availability of substrate influence gene expression.

Keywords

adiA, speF, genová exprese, putrescin, real time-PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Petra Jančová, Ph.D.

Tomas Bata University in Zlín

Faculty of Technology

Master programme / field:
Chemistry and Materials Technology / Environmental Protection Engineering