Diagnostika viru hepatitidy C s použitím metod molekulární biologie

Markéta JAKUBCOVÁ

Bachelor's thesis

The diagnostics of the hepatitis C virus with usage of methods of the molecular biology

Abstract:

Hepatitida C je zánět jater vyvolaný infekcí stejnojmenným virem, který ve 25% případů končí hepatocelulárním karcinomem. V současnosti se rozeznává na 6 různých genotypů s nejméně 50 odlišnými subtypy (3). Virus hepatitidy C rychle podléhá mutacím, výsledkem je, že každý infikovaný jedinec obsahuje směs lehce odlišných variant viru. Unikají kontrole imunitního systému hostitele a z tohoto důvodu často přechází do chronicity. Kvalitativní průkaz je důležitý při zjištění přítomnosti viru, stanovení kvantity viru HCV je důležité při zahájení léčby a hlavně sledování účinnosti léčby (20). Nejčastěji vyšetřujeme krevní sérum nebo plazmu, HCV virus lze diagnostikovat přímo nebo nepřímo. Průkaz anti-HCV protilátek (nepřímý průkaz) metodou Elisa se rutinně provádí ve většině laboratoří a je to základní screening. Detekovatelné anti-HCV protilátky vznikají tři týdny až tři měsíce po primoinfekci (u každého jednotlivce je protilátková odpověď různá), test bývá v časných fázích infekce negativní (21). K průkazu viru se používají mimo jiných i molekulárně biologické metody PCR ? polymerázová řetězová reakce. Pro detekci pomocí PCR je v první fázi třeba vyizolovat virovou RNA (ribonukleovou kyselinu) z biologického materiálu. Viry RNA lze izolovat izolačními přístroji (tzv. izolátory) nebo manuálně s pomocí izolačních kitů (1). Výsledkem může být různý stupeň výtěžnosti a čistoty RNA. Ve své práci jsem používala pouze ruční kolonkovou izolaci. Po získání virové RNA následuje kvalitativní průkaz. Byla použita in house metoda - pomocí RT PCR (PCR s reverzní transkripcí) a následnou PCR se amplifikují specifické úseky virové RNA, které jsou vizualizované gelovou elektroforézou, s použitím ethidium bromidu. Používá se dvoukroková PCR. V prvním kole reakce probíhá reverzní transkripce 30 minut při 50°C, za přítomnosti RNase inhibitoru a enzymu reverzní transkriptázy dojde k přepisu RNA na cDNA, následně k namnožení úseku se specifickými primery. Toto vše je součástí jedné PCR reakce, která probíhá v přístroji tzv. termocycler za přítomnosti specifických primerů, vody, pufru, nukleotidů a specifického enzymu. Pro druhé kolo PCR Nested (zahnízděná PCR) se používají další dvě jiné specifické sekvence primerů, tato PCR se používá pro zvýšení citlivosti a specificity metody. Produkty PCR jsou vizualizované na agarózovém gelu s použitím interkalačního činidla (nejčastěji ethidium bromid) (3). Kvantitativní průkaz pro zjištění hladiny virémie se provádí pomocí real time PCR. Detekce probíhá v reálném čase pomocí fluorescenčních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v průběhu PCR v reálném čase umožňuje průkaz a kvantifikaci produktů. Zároveň je systém schopen identifikovat potenciální PCR inhibici přítomností interní kontroly. Pro kvantifikaci se dodávají externí pozitivní kontroly, s jejichž pomocí lze určit množství viru ve vzorku. Po přidání standard o známé koncentraci do reakce vznikne kalibrační křivka, podle níž lze kvantifikovat vyšetřované vzorky (19). Ve své práci jsem porovnávala 2 izolační soupravy: a) High Pure Viral RNA Kit (Roche) - kit určený k izolaci RNA viru z biologického materiálu (sérum, plazma). V první fázi dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, několikanásobné promytí a poté k eluci RNA do vody ? k použití pro real time ? PCR (8). b) QIAamp Viral RNA mini Kit (Qiagen) ? kit je určený k izolaci virové RNA z lidské plazmy nebo séra. Nejprve dochází k lýze biologického materiálu, uchycení RNA na kolonce s membránou, promytí a eluci RNA do vo

Abstract:

dy - k použití pro real time ? PCR (13). Pro zjištění rozdílů v izolaci byly použity vzorky, které byly kvantifikovány pomocí real time PCR. Prokázal se rozdíl ve výtěžcích RNA mezi výše uvedenými soupravami. Vzorky izolované soupravou QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen) vykazovaly po kvantifikaci vyšší hodnoty naměřené virové RNA.

Abstract:

Hepatitis C is a virus caused liver irritation, which leads to hepatocelular carcinoma in more than a quarter of cases. Six different genotypes with at least fifty different subtypes are known (3). Hepatitis C virus rapidly undergoes mutation, which causes every infected person to have more of slightly different variants of the virus in their body. Consequently, the immune system often loses control over the virus, which can lead to the observed chronicity. Qualitative confirmation is important for determination of the presence of the virus. Quantitative confirmation, on the other hand, is crucial for commencing and monitoring of the treatment. (20) The most often examined species is blood serum, or plasma. HCV can be diagnosed directly, or indirectly. Confirmation of the presence of anti-HCV antibodies (indirectly) by Elisa method is routine and very basic screening in most laboratories. Detectable anti-HCV antibodies occur three weeks to six months after the primoinfection (every person?s immune system reacts differently). This indirect test is usually negative in early phases of infection. (21) For direct confirmation of the virus, solely PCR ? polymerase chain reaction ? methods are used. In the first phase, it is necessary to isolate RNA of the virus from the biological material. This can be done either by a special isolation instrument, or manually, using special isolating kits. Use of different methods may result in different yield and purity of RNA. In my work, I used only hand column isolation. After obtaining the RNA of the virus, qualitative confirmation follows. In my case, an ?In house? method was used ?the RT PCR (reverse transcription PCR) followed by the PCR amplification of specific segment of viral RNA, which are visualized by gel electrophoresis in presence of ethidium bromide, which works as an intercalation species. Double step PCR is used. In the first step, reverse transcription progresses for 30 minutes at 50°C. In the presence of RNase inhibitor and reverse transcriptase enzyme RNA is overwritten to cDNA, which is subsequently multiplicated using specific primers. This process is a part of one PCR reaction, which takes place in the Thermocycler in the presence of specific primers, water, buffer, nucleotides, and specific enzyme. For the second round of Nested PCR two different sequences of primers are used. PCR is used for enhancing the sensitivity and specifity of the method. Products of the PCR are then visualized on the agarose gel with intercalation agent (most commonly ethidium bromide).(3) Quantitative determination of viremia level is carried out with Real Time PCR. Detection proceeds in real time using fluorescence dyes. Dyes are usually bonded onto oligonucleotide probe, which specifically bonds to a PCR amplificate. Measuring the intensity of fluorescence enables confirmation and quantification of the products. The system is also able to identify potencial PCR inhibition with internal control. After addition of standards of known concentration, we can work out a calibration curve and use it to quantify measured samples (19). In this work, two isolation kits are compared: a) High Pure Viral RNA Kit (Roche) ? kit used for isolation viral RNA from biological material (serum, plasma). In the first phase, biological material is decomposed, RNA is collected on the column with membrane, washed multiple times and eluted to water for use in Real Time PCR (8) b) QIAamp Viral RNA mini Kit (Qiagen) ? kit used for isolation of viral RNA from blood plasma, or serum. Firstly, biological material is decomposed, RNA is collected on the column with membrane, washed multiple times and eluted to water for use in Real Time PCR (13).The samples isolated with the QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen) have shown higher values of measured viral RNA after quantification.

Keywords

Hepatitida C, PCR, Kvalitativní průkaz, Kvantitativní průkaz

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2013

Accessible from:: 3. 5. 2013

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Natalja Piskunova, CSc.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Zdravotní laborant