Lokalizace vybraných apoptotických markerů v dozrálých a časně stárnoucích oocytech prasete ovlivněných donory sulfanu

Bc. Kristýna Melounová

Master's thesis

Localization of selected apoptotic markers in matured and early aging porcine oocytes affected by hydrogen sulphide donors

Abstract:

Rozvoj reprodukčních biotechnologií s sebou nese vysoké nároky na kvalitu a kvantitu savčích oocytů. Zisk takových oocytů je ovlivněn zejména správným průběhem jejich in vitro kultivace. Ta je ovšem spojena i s řadou rizik, která mohou kvalitu oocytů narušovat a snižovat tak jejich vývojový potenciál. Velmi problematické je v tomto směru zejména vystavení oocytů prodloužené kultivaci, během které dochází k aktivaci procesu stárnutí. Stárnutí oocytů je zahájeno již několik hodin po dosažení bloku meiózy v metafázi druhého meiotického dělení. Oocyty v této fázi setrvávají pouze omezenou dobu, neboť za fyziologických podmínek dochází k jejich oplození poměrně brzy po ovulaci. V případě, že k oplození nedojde, prochází stárnoucí oocyty řadou biochemických a strukturních změn, které vedou ke snížení jejich kvality a životaschopnosti. Důsledkem těchto změn může být spontánní partenogenetická aktivace, lýza či fragmentace oocytu, která je projevem apoptózy. Programovaná buněčná smrt neboli apoptóza, je v buňkách řízena přes vnitřní a vnější signální dráhy. Do složité regulace apoptózy je zapojena celá řada molekul, mimo jiné i proteiny z rodiny Bcl-2, jejichž hlavní úlohou je regulace aktivity kaspáz, které štěpí proteinové struktury a zahajují tak apoptózu na kaspázách dependentní signální drahou. Dobře známým zástupcem anti-apoptotických molekul je protein Bcl-2, který apoptózu inhibuje. Naopak na aktivaci kaspázové signální dráhy se podílejí pro-apoptotické faktory, například protein BAX. Tyto zmíněné faktory mohou sloužit jako markery apoptózy oocytů. Přesné mechanismy regulace procesu zrání a stárnutí oocytů nejsou ještě detailně popsány. Důležitou roli zde hrají i tzv. gasotransmitery, malé plynné molekuly se signalizační úlohou. Jedním z nich je sulfan, jehož endogenní produkce a úloha během meiotického zrání a stárnutí oocytů již byla potvrzena. Vystavení oocytů zvýšené koncentraci sulfanu prostřednictvím donorů sulfanu, během jejich prodloužené kultivace, vede ke zpomalení průběhu stárnutí. Nejčastěji využívané donory sulfanu jsou látky s tzv. rychlým mechanismem jeho uvolnění. Tento mechanismus se však od fyziologického módu signalizace může výrazně lišit. Cílem této diplomové práce bylo ověření hypotézy, že použití donoru sulfanu s pomalým/kontinuálním mechanismem jeho uvolňování bude efektivnější než použití donoru s rychlým uvolněním sulfanu. Prasečí oocyty byly kultivovány po dobu 48 hodin do stádia MII za přítomnosti jednoho z donorů sulfanu (s pomalým uvolňováním a s rychlým uvolněním). Poté byla v dozrálých a časně stárnoucích oocytech (1 den prodloužené kultivace) provedena lokalizace anti-apoptotického faktoru Bcl-2 a pro-apoptotického faktoru BAX. Kvantitativní zhodnocení relativní intenzity signálu těchto faktorů v jednotlivých skupinách oocytů bylo provedeno pomocí programu NIS Elements. Porovnáním relativní intenzity signálu sledovaných faktorů u skupin dozrálých oocytů ve stádiu MII s kontrolní skupinou byl zjištěn nárůst relativní intenzity signálu anti-apoptotického faktoru Bcl-2 u obou skupin oocytů zrajících za přítomnosti donorů sulfanu. Signifikantně vyšší relativní intenzita byla pozorována u skupiny oocytů zrající s donorem s rychlým mechanismem uvolňování sulfanu (Na2S * 9 H2O), statisticky se však nelišila od donoru s pomalým/kontinuálním mechanismem uvolňování sulfanu. U skupin oocytů ovlivněných donory byla pozorována statisticky významně nižší relativní intenzita signálu pro-apoptotického faktoru BAX oproti kontrolní skupině. Donory se zde signifikantně nelišily. U časně stárnoucích oocytů nebyly mezi skupinami pozorovány statisticky významné rozd

Abstract:

íly při porovnání relativních intenzit signálu anti-apoptotického faktoru Bcl-2. Jinak tomu bylo u pro-apoptotického faktoru BAX, kde byla relativní intenzita signálu signifikantně nižší v obou skupinách stárnoucích oocytů, které byly během meiotického zrání ovlivněny jedním z donorů sulfanu. Lepších výsledků zde bylo dosaženo při použití donoru GYY4137, který se vyznačuje pomalým/kontinuálním uvolňováním sulfanu. Z dosažených výsledků je patrné, že oba typy donorů sulfanu jsou schopny ovlivnit regulaci apoptózy oocytu a tím ve svém důsledku ovlivnit i kvalitu získaných oocytů. Signifikantně lepší výsledky jsme u donoru s pomalým/kontinuálním uvolňováním sulfanu pozorovali pouze u sledovaného faktoru BAX ve skupině časně stárnoucích oocytů, v ostatních skupinách jsme buďto nepozorovali žádné statisticky významné rozdíly nebo se od sebe skupiny oocytů ovlivněné donory vzájemně nelišily. Naše hypotéza byla tedy potvrzena jen částečně. Bylo by zajímavé ještě více imitovat fyziologický průběh signalizace použitím oscilačního módu působení donoru sulfanu a získané výsledky porovnat, to je však již nad rámec zadání této diplomové práce.

Abstract:

The development of reproductive biotechnology brings high demands on the quality and quantity of mammalian oocytes. The gain of such oocytes is mainly affected by the correct course of their in vitro cultivation. However, this is also associated with a number of risks that can disrupt the quality of oocytes and, thus reduce their developmental potential. Particularly problematic in this respect is the exposure of oocytes to prolonged cultivation, during which the aging process is activated. Aging of oocytes begins just a few hours after reaching the block of meiosis in the metaphase of the second meiotic division. Oocytes remain at this stage only for a limited time, as under physiological conditions their fertilization occurs quite soon after ovulation. If fertilization does not occur, aging oocytes undergo a series of biochemical and structural changes that lead to a decrease in their quality and viability. These changes may result in spontaneous parthenogenetic activation, lysis or fragmentation of the oocyte, which is a manifestation of apoptosis. Programmed cell death, or apoptosis, is controlled in cells through internal and external signaling pathways. A number of molecules are involved in the complex regulation of apoptosis, including proteins from the Bcl-2 family, whose main role is to regulate the activity of caspases, which break down protein structures, and thus initiate apoptosis by the caspase-dependent signaling pathway. A well-known representative of anti-apoptotic molecules is the Bcl-2 protein, which inhibits apoptosis. In contrast, pro-apoptotic factors, such as the BAX protein, are involved in activating the caspase signaling pathway. These factors may serve as markers of oocyte apoptosis. The exact mechanisms for regulating the maturation and aging of oocytes have not yet been described in detail. The so-called gasotransmitters, small gaseous molecules with a signaling role, also play an important role here. One of them is hydrogen sulphide, whose endogenous production and role during meiotic maturation and aging of oocytes has already been confirmed. Exposure of oocytes to an increased concentration of hydrogen sulphide through hydrogen sulphide donors, during their prolonged cultivation, leads to a slowdown in the course of aging. The most commonly used hydrogen sulphide donors are substances with the so-called rapid mechanism of its release. However, this mechanism may differ significantly from the physiological mode of signaling. The aim of this diploma thesis is to verify the hypothesis that the use of hydrogen sulphide donor with a slow/continuous release mechanism will be more effective than the use of a donor with rapid release of hydrogen sulphide. Pig oocytes were cultivated for 48 hours to the MII stage in the presence of one of the hydrogen sulphide donors (with slow release and rapid release). Then, in mature and early aging oocytes (1 day of prolonged cultivation), localization of anti-apoptotic factor Bcl-2 and pro-apoptotic factor BAX was performed. A quantitative assessment of the relative signal intensity of these factors in each oocyte group was performed using the NIS Elements program. By comparing the relative signal intensity of the monitored factors in the groups of mature oocytes in stage MII with the control group, an increase in the relative signal intensity of the anti-apoptotic factor Bcl-2 was observed in both groups of oocytes maturing in the presence of hydrogen sulphide donors. Significantly higher relative intensity was observed in the donor oocyte group with rapid hydrogen sulphide release mechanism (Na2S*9 H2O), but statistically it was not different from the donor with a slow/continuous hydrogen sulphide release mechanism. In groups of donor-affected oocytes, a statistically significantly lower relative signal intensity of pro-apoptotic factor BAX was observed compared to the control group. Donors did not differ significantly here. In early aging oocytes, no statist

Abstract:

ically significant differences were observed between the groups when comparing the relative signal intensities of the anti-apoptotic factor Bcl-2. The situation was different with the pro-apoptotic factor BAX, where the relative signal intensity was significantly lower in both groups of aging oocytes which were affected by one of the hydrogen sulphide donors during their meiotic maturation. Better results were achieved here using the donor GYY4137 which is characterized by slow/continuous release of hydrogen sulphide. From the obtained results it is evident that both types of hydrogen sulphide donors are able to influence the regulation of oocyte apoptosis and thus, as a result, affect the quality of the oocytes obtained. Significantly better results were observed using the donor with slow/continuous release of hydrogen sulfide only in the BAX factor observed in the early aging oocyte group, in other groups we either did not notice any statistically significant differences or the groups of oocytes affected by donors did not differ from each other. Our hypothesis was, therefore, confirmed only partially. It would be interesting to imitate even more the physiological course of signaling by using the oscillating mode of action of the hydrogen sulphide donor and compare the obtained results, but that is already beyond the scope of this diploma thesis.

Keywords

oocyt, prase, in vitro kultivace, sulfan

Keywords

in vitro cultivation, hydrogen sulphide, oocyte, pig

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ing. Tereza Krejčová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology