Alternativní molekulárně-genetické metody využitelné při klasifikaci čistých kultur laktobacilů či laktobacilů ze směsných vzorků různého původu

Bc. Olga Fil

Master's thesis

Alternative molecular-genetic techniques usable in classification of strains of lactobacilli or lactobacilli occurring in environmental samples

Abstract:

Řád Lactobacillales zahrnuje významné rody bakterií mléčného kvašení, jejichž konkrétní druhy a kmeny jsou široce využívány v mlékařském, pečivárenském, krmivářském, potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Bakterie mléčného kvašení jsou tradičně používány pro fermentaci potravin a krmiv a jsou všeobecně považovány za prospěšné mikroorganismy. Řada kmenů, zvláště z rodu Lactobacillus, má potvrzené i probiotické vlastnosti, a vyžaduje detailní identifikaci a klasifikaci používaných kmenů. Nedostatky genu pro 16S rRNA (jako třeba přítomnost více sekvenčně odlišných kopií) nutí hledat jiné, evolučně stálé geny, které by mohly být využity pro přesnější klasifikaci. Cílem navrhované práce bylo vytipovat vhodné, dosud nepoužívané, geny pro identifikaci a následnou klasifikaci kmenů řadu Lactobacillales. Následně navrhnout pomocí příslušného softwaru (aplikace PRIMER3) vhodné primery ohraničující žádoucí, variabilní segmenty zvolených genů a ty použít při PCR amplifikaci a sekvenaci příslušných genů u 37 typových kmenů zástupců čeledi Lactobacillaceae (řádu Lactobacillales). Pro splnění cílů práce byly zvoleny geny náležející do skupiny tzv. aminoacyl-tRNA syntetáz: alaS a lysS. Při otestování a zároveň navržení vhodných PCR podmínek potvrdit využití sekvenovaných fragmentů při klasifikaci a fylogenetické analýze zástupců čeledi Lactobacillaceae (řádu Lactobacillales). Výsledky amplifikací, sekvenací a následně fylogenetických studií ukázaly, že pro účely klasifikace určitých zástupců řádu Lactobacillales je lepší gen alaS oproti genu lysS (který byl amplifikován jenom u 18 z 37 testovaných kmenů). Získané výsledky naznačují, že gen alaS může být použit jako klasifikační a fylogenetický biomarker ve specifických fylogenetických skupinách / taxonech řádu Lactobacillales ((zejména pro rody Vagococcus, Enterococcus, Streptococcus a skupinu homofermentativních bakterií mléčného kvašení (dříve jen Lactobacillus)), avšak specifičnost navrhovaného primeru by měla být ověřena pro mnohem větší počet bakteriálních kmenů patřících do různých rodů řádu Lactobacillales.

Abstract:

The order Lactobacillales includes important genera of lactic acid bacteria, whose specific species and strains are widely used in the dairy, bakery, feed, food, and pharmaceutical industries. Many strains, especially of the genus Lactobacillus, have confirmed and probiotic properties, and require detailed identification and classification of the strains used. The shortcomings of the conventional marker 16S rRNA gene, such as the presence of multiple sequence-differentiated copies, drive the research to look for other, evolutionarily stable genes that could be used for more accurate classification. The aim of the proposed work was to identify newly suitable, genes for the identification and subsequent classification of Lactobacillales strains., We used PRIMER3 software to design primers flanking the variable segments of selected genes, alaS, and lysS, encoding aminoacyl-tRNA synthetases. Next, we used our primers in PCR amplification and sequencing of appropriate genes of 37 strains of Lactobacillaceae. Optimal PCR parameters were designed and tested. Then we confirmed the use of sequenced fragments in the classification and phylogenetic analysis of representatives of Lactobacillaceae. The results of amplification, sequencing and subsequent phylogenetic studies showed that to classify certain members of the order Lactobacillales, the alaS gene was better than the lysS gene (which was amplified in only 18 of the 37 strains tested). The obtained results suggest that the alaS gene can be used as a classification and phylogenetic biomarker in specific phylogenetic groups/taxa of the order Lactobacillales especially for the genera Vagococcus, Enterococcus, Streptococcus, and a group of homofermentative lactic acid bacteria, but should be validated for a much larger number of bacterial strains belonging to different genera of the order Lactobacillales.

Keywords

Lactobacillus, Lactobacillaceae, klasifikace, probiotika, genový klasifikační marker, fylogenetika

Keywords

Lactobacillus, Lactobacillaceae, classification, probiotics, gene classification marker, phylogenetics

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Killer, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Farm Products Quality and Processing / Farm Products Quality and Processing