Functional characterization of Arabidopsis thaliana Cu/Zn superoxide dissmutase 1

Bc. Maryna TSINYK

Diplomová práce

Functional characterization of Arabidopsis thaliana Cu/Zn superoxide dismutase 1

Abstract:

Reactive oxygen species (ROS) are products of the aerobic metabolism. ROS regulate developmental processes and stress response in physiological levels, but in excess, they cause oxidative stress and cell death. The balance between the formation and removal of ROS is under the control of the antioxidant system, where the role of superoxide dismutases (SODs) is in the scavenging of superoxide radicals. This work used the model organism Arabidopsis thaliana to characterize Cu/Zn superoxide dismutase 1 (CSD1). In the theoretical section, the function of ROS in plant development and redox signalling is summarized, and the function and regulation of NADPH oxidases are described, as one of the major ROS generators. The main components of the antioxidant system are briefly introduced with a focus on SODs. The role of copper and transcription factor SQUAMOSA promoter binding protein-like7 (SPL7) in the regulation of Fe superoxide dismutase 1 (FSD1) and CSD1 activity has been described. Several goals were successfully achieved in the practical part. As a result of stable Agrobacterium-mediated transformation of csd1 mutant lines, by previously prepared pCSD1::gCSD1:eGFP construct, 4 complemented CSD1-GFP lines with overexpressed CSD1 activity were obtained. Confocal laser microscopy of the obtained CSD1-GFP lines newly revealed nuclear localization of CSD1 in Arabidopsis cells and confirmed known cytoplasmic localization. All obtained lines were validated by SOD activity assay and immunoblot analysis using anti-CSD1 and anti-GFP antibodies. After classical crossing of fsd1 and csd1 mutants two independent lines of both fsd1-1/csd1-1 and fsd1-2/csd1-2 double mutants were selected by PCR-genotyping. Mutants were validated by SOD activity assay and immunoblot analysis using anti-CSD1 and anti-FSD1 antibodies. Measuring the length of the main root and the density of lateral roots in phenotype analysis did not reveal any statistically significant deviations in the csd1 CSD1-GFP lines, unlike the fsd1-1/csd1-1 mutant, which has a shorter primary root. The copper-dependent activity of CSD1 and FSD1 was confirmed with SOD activity assay and Western blot analysis with anti-CSD1 and anti-FSD1 antibodies. Transferring CSD1-GFP seedlings to a media with and without copper showed changes in the intensity of the fluorescent signal of CSD1-GFP, which confirmed functional presence of SPL7 and miRNA398 regulation of CSD1-GFP expression. Additionally, plants from the media without copper were characterized by a point signal in the stomatal nuclei, which may indicate a specific role for CSD1 in the nucleus under these conditions. Finally, construct 35S::gMsCSD2:eGFP (CSD2 gene amplified from Medicago sativa gDNA) was obtained using Multisite Gateway three-fragment cloning. Transient transformation of Nicotiana benthamiana confirmed the functionality of prepared the construct and revealed a cytoplasm and nuclear localization of MsCSD2. The prepared construct will be used for further stable transformation of M. sativa and functional study of CSD2.

Abstract:

Reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou produkty aerobního metabolismu. ROS regulují vývojové procesy a stresovou reakci na fyziologické úrovni, ale v přebytku způsobují oxidační stres a buněčnou smrt. Rovnováha mezi tvorbou a odstraňováním ROS je pod kontrolou antioxidačního systému, kde superoxiddismutasy (SOD) zastávají roli při detoxifikaci superoxidových radikálů. V této práci byl využit modelový organismus Arabidopsis thaliana k charakterizaci Cu/Zn superoxiddismutasy 1 (CSD1). Teoretická část shrnuje funkce ROS ve vývoji rostlin a redoxní signalizaci, je popsána funkce a regulace NADPH oxidas, jakožto jeden z hlavních zdrojů produkce ROS. Hlavní složky antioxidačního systému jsou stručně popsány se zaměřením na SOD. Poslední kapitola teoretické části je věnována úloze mědi a transcripčního faktoru SQUAMOSA promoter binding protein-like7 (SPL7) v regulaci aktivity a abundnance Fe superoxiddismutázy 1 (FSD1) a CSD1. V praktické části se podařilo splnit několik cílů. Byla provedena stabilní transformace mutantních linií csd1 dříve připraveným konstruktem pCSD1::gCSD1:eGFP nesoucí Agrobacterium tumefaciens. Následně byly získány 4 komplementované linie CSD1-GFP, u kterých byl pozorován fluorescenční signál a potvrzena funkční aktivita CSD1-GFP. Konfokální laserová mikroskopie získaných CSD1-GFP linií nově odhalila jadernou lokalizaci CSD1 v buňkách Arabidopsis a potvrdila už známou cytoplazmatickou lokalizaci. Skrze křížení fsd1 a csd1 mutantů byly vyselektovány dvě nezávislé linie dvojitých fsd1-1/csd1-1 a fsd1-2/csd1-2 mutantů, a to pomocí PCR-genotypizace. Mutantní linie byly validovány testem aktivity SOD a imunoblotováním s použitím anti-CSD1 a anti-FSD1 primárních protilátek. Fenotypová analýza, zaměřena na délku primárního kořene a hustotu laterálních kořenů, neodhalila žádné statisticky významné odchylky u linie csd1 a komplementových CSD1-GFP linií. Naopak signifikantní rozdíl v délce primárního kořene byl pozorován u fsd1-1/csd1-1 mutanta. Závislost aktivity CSD1 a FSD1 na mědi byla potvrzena skrze vizualizaci aktivity SOD izoenzymů a pomocí imunoblotu s primárními protilátkami anti-CSD1 a anti-FSD1. Přenos sazenic CSD1-GFP mezi médii s mědí a bez mědi ukázal změny v intenzitě fluorescenčního signálu CSD1-GFP, což potvrzuje zachování regulace exprese CSD1-GFP skrze SPL7 a miRNA398. Semenáčky na médiu bez mědi vykazovaly unikátní zvýšený signál CSD1-GFP v jádrech průduchů, což může naznačovat specifickou roli CSD1 v jádře za těchto podmínek. Získané výsledky výrazně napomohly v chápaní role CSD1 u Arabidopsis a pomohly určit další směr studia tohoto enzymu. Nakonec byl připraven konstrukt 35S::gMsCSD2:eGFP (gen CSD2 amplifikovaný z Medicago sativa gDNA) pomocí Multisite Gateway klonovací technologie. Tranzientní transformace Nicotiana benthamiana potvrdila funkčnost připraveného konstruktu a odhalila cytoplazmatickou a jadernou lokalizaci MsCSD2. Připravený konstrukt bude následně využit pro stabilní transformaci M. sativa a studium CSD2.

Keywords

Arabidopsis thaliana, reaktivní formy kyslíku, redoxní signalizace, oxidační stres, respiratory burst oxidase homologs, antioxidační obrana, superoxiddismutasy, CSD1, SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-like proteins, micro-RNA398

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Petr Dvořák, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie