Optimalizace extrakce nukleových kyselin z půdních vzorků

Mgr. Monika Grätzová

Diplomová práce

Optimization of nucleic acids extraction from soil

Anotace:

Půda je heterogenní polydisperzní systém, který vzniká a vyvíjí se komplexním působením půdotvorných faktorů. Je složena z minerální a organické složky v různých formách. Je přirozeným prostředím velkého množství mikroorganizmů, kteří se významně podílí na půdotvorných procesech, rozkladu a syntéze organických látek a koloběhu živin. Většinu těchto mikroorganizmů však není do dnešní doby možné kultivovat, proto je jejich studium možné pouze s využitím molekulárních metod, jejichž základním krokem bývá extrakce DNA ze všech přítomných mikroorganizmů. K izolaci DNA z buněk je nutná jejich lyze, kterou dosáhneme celou řadou chemických, enzymatických i mechanických metod. Jedním z možných mechanických ošetření půdních vzorků je bead-beating, založený na rychlém třepání vzorku s malými kuličky. V této práci byla srovnávána účinnost mechanického ošetření metodou bead beating na čistých kulturách mikroorganizmů a následně na dvou kontrastních půdních vzorcích. Porovnávány byly účinky dvou materiálů kuliček s odlišnou hmotností při různých intenzitách třepání po různou dobu. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí kultivace, agarózové gelové elektroforézy, spektrofotometrie a DGGE. Byla zjištěna vyšší účinnost lyze u kuliček z těžšího materiálu, avšak při vyšší intenzitě a době třepání vykazovala extrahovaná DNA vysokou fragmentaci.

Abstract:

Soil is heterogeneous polydisperse system formed by complex effect of pedogenic factors. It is composed of mineral and organic components in various forms. Soil is a habitat of large amount of microorganism, that significantly participate in pedogenic processes, decomposition and composition of organic substances and nutrient cycling. Most of these microorganisms are not cultivable, therefore their study is only possible by using molecular methods. First step of these methods is usually DNA extraction from all present microorganisms. To isolate DNA it is necessary to lyse cells by using chemical, enzymatic or mechanical methods. One of the possible mechanical treatments of soil samples is bead-beating based on fast shaking of sample with small beads. In this thesis, the efficiency of bead-beating method was tested on pure microbial cultures and then this method was applied on two contrast soil samples. Two types of beads with different density were compared by using shaking of various intenzity over different period time. Results were evaluated by cultivation, agarose gel electroforesis, spectrofotometry and DGGE. Higher lysis efficiency of heavier beads was detected, but higher intensity and time of shaking caused DNA fragmentation.

Klíčová slova

Bead-beating, DGGE, PCR, Půda, Půdní mikroorganizmy, Soil, Soil microorganisms

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 1. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 2. 2017
• Vedoucí: doc. Ing. Martin Krsek, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Speciální biologie