Genotoxicita polyaromatických sloučenin v jaterních progenitorových buňkách

Mgr. Soňa Marvanová, Ph.D.

Doctoral thesis

Genotoxicity of polyaromatic compounds in liver progenitor cells

Abstract:

Játra představují centrální orgán metabolismu xenobiotik. Obsahují několik typů buněk, včetně buněk progenitorových, které mohou v případě rozsáhlého poškození jater proliferovat a nahradit poškozené buňky. Vedle této role při regeneraci jater se mohou progenitorové buňky také stát cílem chemických karcinogenů a hrát roli v hepatokarcinogenezi. Přesto je většina studií zabývajících se účinky polyaromatických uhlovodíků (PAU), významných environmentálních kontaminantů, dosud zaměřena na diferencované buňky nebo jejich deriváty. V prezentované práci byly jako buněčný model pro studium genotoxických efektů PAU použity buňky WB-F344, potkaní jaterní epiteliální buněčná linie, sdílející řadu vlastností s progenitorovými buňkami. Z vybraných karcinogenních PAU byly dibenzo[a,l]pyren (DBalP), benzo[a]pyren, benzo[g]chrysen a dibenzo[a,e]pyren schopny vytvářet v buňkách WB-F344 stabilní DNA adukty s následnou aktivací proteinu p53 a apoptózou. Naproti tomu další karcinogenní PAU chrysen, benz[a]anthracen, benzo[b]fluoranthen a dibenzo[a,h]anthracen tyto genotoxické účinky nevyvolávaly a na základě předchozích studií lze předpokládat, že v jejich působení na jaterní progenitorové buňky hrají významnější roli tumor-promoční efekty. Na příkladu DBalP bylo za použití inhibitorů cytochromu P450 (CYP) 1B1 potvrzeno, že CYP1B1 hraje jednu z klíčových rolí v genotoxických a cytotoxických procesech indukovaných PAU. Některé monomethylované deriváty benzo[a]anthracenu (MeBaA) ve starších studiích projevovaly tumor-iniciační, karcinogenní a mutagenní účinky v hlodavčích kožních a bakteriálních modelech. V modelu jaterních progenitorových buněk WB-F344 pouze 10-MeBaA vyvolával mírně genotoxické účinky, a to tvorbu stabilních aduktů DNA, fosforylaci proteinu p53, apoptózu, zvýšené procento buněk v S-fázi buněčného cyklu a zvýšenou produkci reaktivních kyslíkových radikálů. Ostatní MeBaA v buňkách WB-F344 tyto genotoxické účinky nevyvolávaly, ale byly schopny aktivovat receptor AhR silněji než jejich parentální sloučenina BaA. Tímto mechanismem, aktivitou zprostředkovanou receptorem AhR, mohou významně přispívat k toxicitě environmentálních směsí. Výsledky také poukazují na rozdílnou tkáňovou specifitu účinků PAU. Environmentální polutant 7H-dibenzo[c,g]karbazol (DBC) a jeho syntetický derivát 5,9-dimethyldibenzo[c,g]karbazol (diMeDBC), vykazující striktní hepatokarcinogenitu, v buňkách WB-F344 vyvolávaly efekty související s jejich silnou genotoxicitou (fosforylace p53, akumulace buněk v S-fázi a apoptóza). Další syntetický derivát, sarkomagenní N-methyldibenzo[c,g]karbazol (N-MeDBC) tyto účinky nevyvolával. DiMeDBC ale překvapivě nevytvářel adukty s DNA a na druhé straně N-MeDBC vyvolával vznik zlomů na DNA i mikrojader v buňkách WB-F344. Podrobnější studium genotoxických efektů ukázalo, že zatímco příčinou genotoxicity DBC jsou stabilní DNA adukty, v případě diMeDBC by mohlo být za genotoxicitu zodpovědné oxidativní poškození nebo modifikace bází. N-MeDBC vyvolával sice nízkou hladinu aduktů na DNA, ale pravděpodobně dostačující pro vznik zlomů na DNA a mikrojader. Tato poškození byla nicméně účinně opravena a neprojevila se na buněčné úrovni. Buňky WB-F344 byly dále použity jako model pro studium genotoxických a tumor-promočních efektů vzorku ovzduší - městského prachu, standardního referenčního materiálu SRM 1649a a jeho chromatografických frakcí. Extrakt SRM 1649a a polární frakce vyvolávaly genotoxické účinky (apoptóza, fosforylace p53 a snížení počtu buněk) pouze v nejvyšších koncentracích. Mezi DNA adukty, vytvořenými po expozici extraktem SRM, byly identifikovány pouze adukty BaP-dihydrodiolepoxidu a ve velmi malé míře ad

Abstract:

ukty DBalP-dihydrodiolepoxidu. Efekty asociované s nádorovou promocí (aktivace receptoru AhR, indukce mRNA CYP1A1 a CYP1B1 a proliferace) se projevovaly už od nízkých koncentrací celkového extraktu SRM, polární frakce i neutrální frakce obsahující PAU. Tyto výsledky potvrzují, že genotoxicita PAU ve směsích není aditivní, ale její výsledný efekt je slabší, pravděpodobně díky inhibici enzymů metabolické aktivace CYP1 některými PAU přítomnými ve směsi, a dále naznačují významnost tumor-promočních efektů, projevujících se na rozdíl od genotoxicity v nižších koncentracích.

Abstract:

The liver represents a central organ of xenobiotic metabolism. It consists of several types of cells, including progenitor cells, which are able to proliferate in case of extensive liver damage and replace the damaged cells. Besides their role in liver regeneration, these progenitor cells might be a target of chemical carcinogens and thus play a role in hepatocarcinogenesis. Nevertheless, most of the studies dealing with the effects of polyaromatic hydrocarbons (PAHs), important environmental contaminants, are focused on the differentiated cells or their derivatives. In this thesis, rat liver epithelial cell line WB-F344, sharing many characteristics with progenitor cells, was used as a cellular model for the research of genotoxic effects of PAHs. From the group of selected carcinogenic PAHs, dibenzo[a,l]pyrene (DBalP), benzo[a]pyrene, benzo[g]chrysene and dibenzo[a,e]pyrene were able to induce the formation of stable DNA adducts with subsequent protein p53 activation and apoptosis in the cell line WB-F344. In contrast, the other selected carcinogenic PAHs chrysene, benz[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene and dibenzo[a,h]anthracene did not induce these genotoxic effects and on the basis of previous studies it could be assumed that their tumor-promoting effects might play a more important role in their activity in liver progenitor cells. Next, using DBalP and the inhibitors of cytochrome P450 (CYP) 1B1 activity, we confirmed that CYP1B1 played a significant role in genotoxic and cytotoxic processes induced by PAHs. In former studies, several monomethylated derivatives of benz[a]anthracene (MeBaAs) have exhibited tumor-initiating, carcinogenic and mutagenic effects in rodent skin and bacterial models. In the WB-F344 cell line, only 10-MeBaA induced slight genotoxic effects, such as formation of stable DNA adducts, phosphorylation of protein p53, apoptosis, accumulation of cells in S-phase of the cell cycle and increased formation of reactive oxygen species. Other MeBaAs did not induce these genotoxic effects in the WB-F344 cells, but were able to activate the Ah receptor stronger than their parental compound BaA. Therefore they may contribute significantly to the toxicity of environmental mixtures through AhR-mediated activity. The results of the study also point to different tissue specificity of methylated PAHs. Environmental contaminant 7H-dibenzo[c,g]carbazole (DBC) and its synthetic derivative 5,9-dimethyldibenzo[c,g]carbazole (diMeDBC), strict hepatocarcinogen, induced effects connected with their strong genotoxicity in cells WB-F344 (phosphorylation of p53, cell accumulation in S-phase and apoptosis). Another synthetic derivative of DBC, sarcomagen N-methyldibenzo[c,g]carbazole (N-MeDBC) did not induce these effects. Surprisingly, diMeDBC did not induced formation of DNA adducts, while N-MeDBC caused formation of DNA strand breaks and micronuclei in WB-F344 cells. More detailed study of genotoxic effects showed that while the cause of DBC genotoxicity is the formation of DNA adducts, in case of diMeDBC, the oxidative damage or base modifications might be responsible for its genotoxicity. N-MeDBC induced low level of DNA adducts, but these were probably sufficient to form DNA strand breaks and micronuclei. Nevertheless, this damage was efficiently repaired and did not exert on the cell level. Next, the WB-F344 cells were used as a model for study of genotoxic and tumor-promoting effects of air particulate sample (urban dust), Standard Reference Material SRM 1649a and its chromatographic fractions. The extract of SRM 1649a and polar fraction induced genotoxic effects (phosphorylation of p53, apoptosis and decreased number of cells) only at the highest doses used. Of DNA adducts formed by SRM extract, only BaP-dihydrodiolepoxide adducts were identified, as well as a very small amount of DBalP-dihydrodiolepoxide adducts. Crude extract of SRM, neutral fraction containing PAHs and polar fraction exerted effects associated with

Abstract:

tumor promotion (AhR activation, induction of mRNA CYP1A1 and CYP1B1 and proliferation), already in low doses. These results confirmed that genotoxicity of PAHs in mixtures is not additive, but instead, their final effect is lower than expected, most probably due to inhibition of xenobiotic metabolizing enzymes CYP1 by some PAHs present in the mixture. The results also indicate the importance of tumor-promoting effects, observed already in lower doses, contrary to genotoxicity.

Keywords

Polyaromatické sloučeniny, genotoxicita, apoptóza, protein p53, proliferace, Ah receptor, jaterní progenitorové buňky. Polyaromatic compounds, genotoxicity, apoptosis, proliferation, liver progenitor cells.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2009
• Supervisor: RNDr. Miroslav Machala, CSc.
• Reader: doc. Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D., doc. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D., Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry