Příprava plazmidových konstruktů pro integraci AMP-deaminasy do kvasinek

Vendula Kajnarová

Bakalářská práce

Preparation of plasmid constructs for integration of AMP deaminase into yeast

Anotace:

V dnešní době jsou různé metody biologie a chemie vyvinuty natolik, že mohou být člověkem využívány k manipulaci s různými organismy za účelem zisku kvalitnějších surovin, materiálů a produktů rostlinného či živočišného původu. Pro takovouto manipulaci s organismy hraje klonování dnes důležitou úlohu hlavně v zemědělství a biotechnologických oborech. Častým modelem pro klonování jsou kvasinky. Tato bakalářská práce je zaměřena právě na tyto jednobuněčné houbové mikroorganismy, konkrétně na Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris a jejich vlastnosti. AMP-deaminasa je enzym s homotetramerní strukturou, který katalyzuje deaminaci AMP za vzniku IMP a amoniaku. Jelikož dříve byly geny pro AMP-deaminasu exprimovány neúspěšně v Escherichia coli, byly připraveny konstrukty umožňující expresi genů AMD1 původem ze S. cerevisiae a SPBC106.04 původem ze Schizosaccharomyces pombe v kvasinkách. V experimentální části byly připraveny plazmidové konstrukty pro expresi AMP-deaminas v P. pastoris (pGAPZ? A s SPBC106.04 a pPICZ A s SPBC106.04) a dále v S. cerevisiae (pDR197 s AMD1). Rozdíl mezi vektory je ve výběru promoteru, AOX1 v pPICZ A je inducibilní methanolem. U pGAPZ? A a pDR197 je použit promotor konstitutivní. Vektor pGAPZ? A obsahuje navíc ?-faktor, který umožňuje sekreci proteinu do média. U vektoru pPICZ A a pDR197 protein zůstává v buňkách. Vektory pPICZ A a pGAPZ? A vnášejí do rekombinantního proteinu histidinovou kotvu, která umožňuje snadnou a rychlou purifikaci proteinu; pDR197 nevnáší aditivní úsek do AMP-deaminasy. Dalším rozdílem mezi použitými vektory je stabilní integrace expresní kazety do genomu P. pastoris (pGAPZ? A a pPICZ A) nebo exprese AMP-deaminasy (přítomné na plazmidu pDR197) v S. cerevisiae, bez předchozí integrace do genomové DNA

Abstract:

Nowadays, various methods are developed in biology and chemistry, so that they can be used for manipulation of various organisms in order to gain higher quality raw materials, materials and products of plant or animal origin. For handling such organisms, cloning plays an important role especially in agriculture and biotechnology fields today. Common model for cloning are yeasts. This thesis is focused on these single-celled fungal organisms, namely Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris and their features. AMP deaminase is an enzyme with homotetramer structure which catalyzes deamination of AMP to IMP and ammonia. In past, AMP deaminase genes were not successfully expressed in Escherichia coli. Suitable constructs with AMD1 (S. cerevisiae) and SPBC106.04 (S. pombe) genes for the yeast expression have been prepared. In the experimental part, plasmid constructs for expression of AMP deaminase in P. pastoris (pGAPZ? A with SPBC106.04 and pPICZ A with SPBC106.04) and in S. cerevisiae (pDR197 with AMD1) have been prepared. The difference between the vectors is at the selection of promoter, AOX1 in pPICZ A is inducible with methanol. For pGAPZ? A and pDR197, a constitutive promoter has been chosen. Vektor pGAPZ? A contains, in addition, ?-factor which allows protein secretion into the medium. Protein expressed from pDR197 and pPICZ A vectors remains in the cells. Vectors pPICZ A and pGAPZ? A bring into the recombinant protein polyhistidine tag, which allows quick and easy protein purification; pDR197 does not introduce an additive fragment into the AMP deaminase. The other difference among the applied vectors is stable integration of expression cassette into the genome of P. pastoris (pGAPZ? A and pPICZ A) or expression of AMP deaminase (present in the plasmid pDR197) in S. cerevisiae but without integration into genomic DNA

Klíčová slova

AMP-deaminasa, P. pastoris, pGAPZ A, pPICZ A, pDR197

Keywords

AMP deaminase, P. pastoris, pGAPZ A, pPICZ A, pDR197

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2010
• Vedoucí: Hana Pospíšilová
• Oponent: Petra Rozumová

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie