Příprava CRISPR/Cas konstruktů pro deleci CRE1 promotoru v Arabidopsis thaliana

Bc. Andrea RADKOVÁ

Bakalářská práce

Preparation of CRISPR/Cas constructs for deletion of the CRE1 promoter in Arabidopsis thaliana

Anotace:

Arabidopsis thaliana neboli Huseníček rolní je drobná dvouděložná rostlina, která se využívá jako modelový organismus v molekulární genetice rostlin. A. thaliana se stala modelovou rostlinou z toho důvodu, že má nejmenší a kompletně sekvenovaný genom v rostlinné říši. Pomocí funkční analýzy genů mohou být prováděny editace genomů - cílené mutace, delece či inzerce. V současnosti se pro editaci genomu využívá nejnovější metoda CRISPR/Cas, která prostřednictvím dvou komponent, proteinu Cas a gRNA, dokáže zasahovat do genomu všech organismů a zavádět tak mutace v konkrétním místě DNA. Tato bakalářská práce je zaměřena na přípravu CRISPR/Cas konstruktů, které povedou k vytvoření delece v oblasti promotoru genu CRE1, který kóduje cytokininový receptor. Celkem byly připraveny čtyři CRISPR/Cas konstrukty. Dva připravené destinační vektory obsahovaly Cas12a a gRNA s protospacerovou sekvencí cílenou na 701. bp nebo 1222. bp pCRE1. Další dva destinační vektory obsahovaly Cas9 a gRNA s protospacerovou sekvencí cílenou na 281. bp nebo 559. bp pCRE1. Z důvodu pandemie COVID-19 nebylo možné v práci pokračovat, nicméně cílem bylo vytvořit konstrukty s Cas9 či Cas12a se dvěma gRNA s různými protospacery tak, aby díky přítomnosti obou protospacerů v jednom destinačním vektoru došlo v A. thaliana k deleci pCRE1. Tyto CRISPR/Cas konstrukty budou dále transformovány do Agrobacterium tumefaciens GV3101 a následně metodou floral dip do A. thaliana Col 0.

Abstract:

Arabidopsis thaliana, or Huseníček rolní, is a tiny, double-womb plant that is used as a model organism in the molecular genetics of plants. A. thaliana became a model plant because of its smallest and completely sequenced genome in the plant kingdom. Genome editing - targeted mutations, deletions, or insertions - can be achieved by using functional gene analysis. Currently, the latest CRISPR/Cas method is used for genome editing, which, through two components: Cas protein and gRNA, can interfere with the genome of all organisms, and thus introduce mutations in a specific site of DNA. This bachelor thesis is focused on the preparation of CRISPR/Cas constructs that will lead to the creation of a deletion in the promoter region of the CRE1 gene, which encodes the cytokinin receptor. Together, four CRISPR/Cas constructs were prepared. Two prepared destination vectors contained Cas12a and gRNA with the protospacer targeting the 701st or 1222nd bp of pCRE1. The other two destination vectors contained Cas9 and gRNA with a protospacer targeting 281st bp or 559th bp pCRE1. Due to the COVID-19, it was not possible to continue, however, this thesis aimed to create constructs with Cas9 or Cas12a and two gRNAs with different protospacer sequences so that due to the presence of both protospacers in one destination vector, pCRE1 could be deleted in A. thaliana. These CRISPR/Cas constructs will be further transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101 and then by the floral dip method into A. thaliana Col-0.

Klíčová slova

Arabidopsis thaliana, CRISPR/Cas, pCRE1

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 5. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2021
• Vedoucí: Mgr. Michaela Králová

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie