Regulace biosyntézy vysoce nenasycených mastných kyselin (LC-PUFA) u ryb

Ing. Zuzana BLÁHOVÁ

Doctoral thesis

Regulation of long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) biosynthesis in fish

Abstract:

The aim of the thesis was to explore the biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) with special focus on its role in adaptation to new environmental conditions in fish. The impact of impaired LC-PUFA pathway on reproduction of zebrafish (Danio rerio) was studied by the modern reverse genetic approach CRISPR/Cas9. Throughout the Earth´s history, the living organisms evolved to its current form in response to natural climate change, a slow natural phenomenon that has lasted for thousands or millions of years. However, in recent less than 100 years, anthropogenic factors induced a rapid process of global warming. Nutritional quality, when defined as the value of the product for the consumer´s physical health, growth, development and reproduction, is at a risk. Long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) biomolecules are essential dietary components for virtually all animals and humans. However, LC-PUFAs provisioning by changing ecosystems is predicted to decline significantly. Animals and human are usually able to produce LC-PUFAs endogenously from shorter and less unsaturated C18 fatty acid precursors obtained from the diet. However, the yield of LC-PUFA biomolecules biosynthesized is too low to meet physiological needs. Rather, LC-PUFA biosynthesis is considered to play a role as a compensational apparatus to maintain homeostasis under fluctuating environmental conditions. The first and rate-limiting step in LC-PUFA biosynthesis is catalysed by FADS2 enzyme. It has been demonstrated that fads2 was the key metabolic gene important for overcoming the nutritional constraints associated with colonisations of nutritionally pure water environments after glacial retreat. In human population, fads2 showed strong signatures of selection as well as confirmed in Greenland Eskimos colonising polar regions. Chapter 2 of the thesis summarized the current knowledge and assessed fatty acid desaturase (FADS2) structure-function properties in fish in the context of environmental adaptations and as a target for genetic engineering. The work highlighted the FADS2 potential to play roles fundamental to adaptation to novel environmental conditions and reviewed investigations to elucidate the evolutionary history of fish FADS2, explaining the remarkable plasticity of this enzyme in fish, depicted the importance of FADS2 in the context of dwindling LC-PUFAs supply and mentioned a few remedies in the form of genetic engineering to improve endogenous LC-PUFA biosynthesis. FADS2 was presented as a fascinating enzyme with far-reaching implications for environmental sustainability and playing roles in adaptations to novel environments. Previous research has provided substantial evidence of significant effects of dietarily obtained LC-PUFA levels and ?3: ?6 LC-PUFA balance on broodstock reproduction success (Sarih et al., 2020). However, the information on the impact of ablation of LC-PUFAs of endogenous origin was missing in fish and other anamniotic vertebrates as well. That fact prompted us to fill this gap of knowledge. Chapter 3 of this thesis investigated a direct functional link between fads2 gene and reproduction success in zebrafish (Danio rerio) by reverse genetic approach. We have investigated the functional link between FADS2 and reproduction success of zebrafish females by observing the direct impact of partial fads2 gene knock out on their egg batches fatty acyl methyl ester (FAMEs) profile. We observed the presence of an alternative ?8 desaturation pathway (elongation ? ?8 desaturation ? ?5 desaturation) besides the classical ?6 pathway (?6 desaturation ? elongation? ?5 desaturation) in zebrafish in vivo, which we explain as an active regulation of LC-PUFA biosynthesis under the depletion of functional fads2 gene alleles following the CRISPR/Cas9 genome targeting. We suggest that zebrafish bifunctional ?6/ ?5 desaturase is, in fact, the trifunctional ?8/?6/?5 desaturase.

Abstract:

Předložená dizertační práce se zabývá studiem biosyntézy vysoce nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem u ryb, přičemž se zaměřuje na její roli v adaptaci ryb na nové měnící se podmínky životního prostředí. V experimentální části zkoumá vliv narušené dráhy LC-PUFA biosyntézy na reprodukci ne modelovém organizmu ryby zebřičky (Danio rerio) reverzně genetickým přístupem využívajícím populární systém CRISPR/Cas9. Po celou dobu historie Země se živé organizmy vyvíjely v reakci na přirozenou změnu klimatu, pomalý přírodní jev trvající tisíce až miliony let. V posledních necelých 100 letech však lidské činnosti vyvolaly překotné globální oteplování. Kvalita potravy, pokud ji definujeme jako hodnotu produktu pro fyzické zdraví, růst, vývoj a reprodukci, je ohrožena. Klesá v ní totiž zastoupení jedněch z esenciálních složek potravy pro prakticky všechna zvířata a pro člověka vysoce nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem (LC-PUFA). Zvířata a lidé obvykle mají schopnost tvořit si tyto biomolekuly uvnitř svých buněk z esenciálních kratších a méně nenasycených osmnáctiuhlíkových mastných kyselin, ovšem výtěžek takto vytvořených molekul je příliš nízký na to, aby pokryl fyziologické potřeby organizmu. Spíše je předpokládáno, že tato dráha plní funkci jakéhosi kompenzačního aparátu jehož úkolem je udržení homeostázy za kolísajících podmínek prostředí. První krok LC-PUFA biosyntézy je katalyzován enzymem FADS2. Bylo prokázáno, že fads2 byl klíčovým metabolickým genem, který v minulosti umožnil kolonizování nutričně chudého prostředí sladkých vod po ústupu ledovců některým rybám. A dokonce i v lidské populace vykazoval fads2 gen silné známky selekce, jak bylo prokázáno u grónských Eskymáků osídlujících polární oblasti. Kapitola 2 této práce shrnuje současné poznatky a zhodnocuje strukturně-funkční vlastnosti desaturázy FADS2 u ryb v kontextu adaptací na prostředí a jako cíle pro genetické inženýrství. Práce zdůraznila potenciál FADS2 hrát zásadní roli v přizpůsobování se novým podmínkám prostředí, zhodnotila dosavadní výzkum v této oblasti s cílem objasnit evoluční historii FADS2 u ryb přičemž vyzdvihuje pozoruhodnou plasticitu FADS2. Nastínila I některá řešení genetického inženýrství v podobě geneticky modifikovaných organizmů. Prezentovali jsme FADS2 jako fascinující enzym s dalekosáhlými důsledky pro udržitelnost životního prostředí. Z dosavadního výzkumu jasně plyne, že množství a kompozice LC-PUFA přijmutích v potravě ovlivňují reprodukční vlastnosti generačních ryb. Dosud však nebyl studován vliv delece genu fads2 (úbytku endogenně vytvořených LC-PUFA biomolekul) na reprodukci u ryb a dokonce i u anamniote obecně. Cílem práce shrnuté v kapitole 3 této práce proto bylo zjistit, zda existuje přímá funkční souvislost mezi genem fads2 a některými vlastnostmi souvisejícími s reprodukcí u vybraného modelového organizmu ryby - zebřičky (Danio rerio) reverzně genetickými přístupy. Zhotovili jsme "knockout" zebřičky fads2 genu a poté jsme stanovili profil mastných kyselin jiker, které dospělé samice kladly. Pozorovali jsme existenci alternativní ?8 desaturační dráhy (elongace ? ?8 desaturace ? ?5 desaturace) vedle klasické ?6 dráhy (?6 desaturace ? elongace? ?5 desaturace) u samic zebřiček in vivo. Vysvětlujeme si ji jako aktivní regulaci biosyntézy LC-PUFA za podmínek nedostatku funkčních alel fads2 genu v důsledku cílených mutací pomocí metody cíleného editování genomu CRISPR/Cas9. Dospěli jsme k závěru, že bifunkční desaturáza ?6/ ?5 je ve skutečnosti trifunkční ?8/?6/?5 desaturáza.

Keywords

Biosyntéza polynenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem (LC-PUFA), \recke{Delta}6, ?5, ?8 desaturáza FADS2, ?3, ?6, CRISPR/Cas9 knockout, zebřička (Danio rerio), environmentální adaptace, kyselina linoleová (LA), eicosadienová, dihomo ?-linolenová (DGLA), arachidonová (AA), ?-linolenová (ALA), eicosatrienová, stearidonová (SDA), eicosapentaenová (EPA), docosahexaenová (DHA).

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 31. 8. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Ing. Martin Pšenička, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / odbor:
Zootechnics / Fishery