Identifikace molekulárních cílů protinádorových léčiv afinitní purifikací.

Bc. Barbora PASTORKOVÁ

Master's thesis

Identification of molecular targets for anticancer drugs by affinity purification.

Abstract:

Identifikace molekulárních cílů je velmi důležitá pro zjištění mechanismu účinku daného léčiva. Afinitní purifikace s jejími různými variantami je nejvíce používaná metoda při izolaci a identifikaci molekulárních cílů jak přírodních bioaktivních látek, tak farmaceuticky syntetizovaných léčiv. Cílem této práce byla identifikace molekulárních cílů protinárodových léčiv konkrétně indazolových derivátů, které mají vliv na buněčný cyklus a jsou významné díky své antiproliferativní a apoptotické aktivitě. Molekulární cíl těchto látek byl testován na suspenzní buněčné linii odvozené od akutní T-lymfoblastické leukémie CCRF CEM, která byla značená pomocí lehkých a těžkých izotopů uhlíku tzv. SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture), metodou afinitní purifikace, která spočívá v zachycení cílových proteinů na afinitní matrici, eluci těchto proteinů, jejich digesci a identifikaci pomocí hmotnostní spektrometrie. Při identifikaci molekulárních cílů byly využity dvě strategie afinitní purifikace. První probíhala bez kompetice a druhá s kompeticí o volnou testovanou látku. V průběhu testování docházelo zároveň k optimalizaci metody, čili došlo k mnoha větším či menším úpravám v postupu. Byly využity dva druhy mobilní afinitní matrice: magnetické a agarózové kuličky. Použity byly dva typy trypsinové digesce proteinů a to digesce v roztoku a digesce v gelu. Peptidy byly přečišťovány pomocí Macro Trap kolony nebo reverzní fáze C18 ve špičkách. Při hmotnostní spektrometrii byly aplikovány dva druhy ionizace peptidů: MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization) - matricí asistovaná laserová ionizace a ESI (electrospray ionization) ionizace pomocí elektrospereje a dva typy hmotnostních analyzátorů: analyzátor doby letu TOF (time of flight) a nebo kombinace lineární iontové pasti a Orbitrapu.

Abstract:

The identification of molecular targets is very important to determine the mechanism of action of the drug. Affinity purification with its various alternatives is the most used method for the isolation and identification of molecular targets as natural bioactive small molecules and pharmaceutically synthesized drugs. The aim of this work was to identify molecular targets anticancer drugs specifically indazole derivatives which have an effect on the cell cycle and are important because of their antiproliferative and apoptotic activity. Molecular target of these compounds was tested on a suspension cell line derived from acute T - lymphoblastic leukemia CCRF-CEM which was labeled by stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). Affinity purification method, which consists of capturing of the target protein to an affinity matrix; the elution of the proteins, their digestion and identification by mass spectrometry was used. Two strategies of affinity purification have been used for identification of molecular targets. The first was carried out without competition, and the second one with competition for the free small molecule. During the testing process, the procedure was optimalized. Therefore there have been many small or large changes in the procedure. They were used two types of mobile affinity matrix: a magnetic and agarose beads. Two types of tryptic digestion of proteins were used: digestion in solution and digestion in gel. Peptides were purified, using Macro Trap column or a reverse phase C18 in the tips. In mass spectrometry were applied to two types of ionization of peptides: matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI). Combination of two types of mass analyzators was used: time of flight analyzator TOF and a combination of linear ion trap and Orbitrap.

Keywords

chemická genetika, chemická proteomika, SILAC, afinitní purifikace, hmotnostní spektrometrie, indazolové deriváty

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 5. 2014

Accessible from:: 2. 5. 2014

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Petr Džubák, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology