In vitro toxické účinky derivátů Amaryllidaceae alkaloidů na buňky střevního epithelu

Bc. Sára Horáková

Master's thesis

In vitro toxic effects of Amaryllidaceae alkaloid derivatives on intestinal epithelial cells

Abstract:

Onkologická onemocnění jsou jednou z hlavních příčin celosvětové úmrtnosti. Za rok 2018 bylo diagnostikováno 18 milionů nových případů a evidováno 9,5 milionů úmrtí. Dle dostupných prognóz má navíc každoročně stoupat počet nově diagnostikovaných pacientů. To může souviset nejen se znečištěným životním prostředím, ale i s nezdravým životním stylem a stárnutím populace. V rámci statistik patří Česká republika na první příčky ve výskytu kolorektálního karcinomu, který patří mezi nejčastější nádorová onemocnění s relativně vysokým procentem úmrtnosti. Vysoká míra výskytu je způsobena kombinací nezdravého životního stylu, genetické predispozice a vnějších faktorů, jako jsou věk, pohlaví či rasová příslušnost. Rostoucí trendy výskytu jsou spojovány s nadměrným příjmem živočišných tuků, nízkou spotřebou vlákniny, nedostatkem fyzické aktivity a obezitou. Největším problémem tohoto nádorového onemocnění je pozdní diagnostika nemoci, odolnost pacienta vůči léčbě a přítomnost metastáz. Z tohoto důvodu se hledají přírodní nebo syntetické látky, které mohou mít potencionálně protinádorový efekt. Z předchozího základního výzkumu je patrné, že alkaloidy rostlin čeledi Amaryllidaceae působí toxicky na lidské nádorové buněčné linie včetně kolorektálního karcinomu. U těchto sekundárních metabolitů je významná jejich vysoká selektivita pro nádorové buňky a poměrně nízká toxicita k zdravým či klidovým buňkám. Také bylo zjištěno, že příprava jejich polosyntetických nebo syntetických derivátů může vést k objevení nových analogů se srovnatelnou či ještě vyšší úrovní cytotoxické aktivity. Na základě těchto poznatků se tato práce zabývá novými deriváty Amaryllidaceae alkaloidů na buněčných liniích kolorektálního karcinomu Caco-2 a HT29. Pro určení selektivity byla použita buněčná linie tenkého střeva FHS 74Int. Cytotoxická aktivita 38 synteticky připravených derivátů byla testována pomocí MTT testu využívající tetraziolové soli tetrazol bromidu k jeho redukci v mitochondriích živých buněk na nerozpustný formazán. Z našich výsledků vyplývá, že pouze u čtyř derivátů lze hovořit o tom, že působí cytotoxicky. Konkrétně se jedná o derivát galanthaminu (IC50 u buněčné linie Caco-2 6,07 ± 2,87 µM/ml), pankracinu (IC50 na HT29 buňkách 8,20 ± 0,91 µM/ml), ambellinu (IC50 na HT29 buňkách 3,23 ± 0,17 µM/ml a na Caco-2 buňkách 1,86 ± 0,32 µM/ml) a haemanthaminu (IC50 na HT29 buňkách 2,43 ± 0,13 µM/ml a na Caco-2 buňkách 0,78 ± 0,18 µM/ml). U ostatních testovaných derivátů nebyla cytotoxicita prokázána (IC50 >10 µM/ml).Navzdory tomu, že u některých derivátů byla zjištěná hodnota IC50 nižší než 10 µM/ml, nejedná se stále o látky s výrazným toxickým účinkem na nádorové buněčné linie, a kromě derivátu haemanthaminu, zde není výrazný potenciál pro jejich případné využití.

Abstract:

Cancer is one of the leading causes of mortality worldwide. In 2018 18 million new cases were diagnosed and 9,5 million deaths were recorded. In addition, according to available forecasts, the number of newly diagnosed patients should increase every year. This can be related not only to a polluted environment, but also to an unhealthy lifestyle and an aging population. In addition, the Czech Republic ranks among the first in the occurance of colorectal cancer, which is one of the most common cancers with a relatively high mortality rate. The high occurance is due to a combination of unhealthy lifestyles, genetic predisposition and external factors such as age, gender or race. Rising incidence trends are associated with excessive intake of animal fats, low fiber consumption, lack of physical activity and obesity. The biggest problems with this cancer are late diagnosis of the disease, the patient's resistance to treatmentand the presence of metastases. For this reason, there is an effort to look for natural or synthetic substances that can have a potential antitumor effect. From previous basic research, it is clear that alkaloids of plants of the Amaryllidaceae family are toxic to human tumor cell lines, including colorectal cancer. These secondary metabolites are characterized by their high selectivity for tumor cells and relatively low toxicity to healthy or resting cells. Furthermore, it was found that the preparation of their semi-synthetic or synthetic derivatives may lead to the discovery of new analogues with comparable or even higher levels of cytotoxic activity. Based on these findings, this work deals with new derivatives of Amaryllidaceae alkaloids on Caco-2 and HT29 colorectal cancer cell lines. The FHS 74Int small intestine cell line was used to determine selectivity. Cytotoxic activity of 38 synthetically prepared derivatives was tested by MTT test using tetraziol salt tetrazole bromide to a reduction in the mitochondria of living cells into an insoluble form and inflammation. The results show that only four derivatives can cause cytotoxicity. Specifically it is a derivative of galanthamine (IC50 in the cell line Caco-2 6,07± 2,87 µM/ml), pancracine (IC50 on HT29 cells 8,20 ± 0,91 µM/ml), ambelline (IC50 on HT29 cells 3,23 ± 0,17 µM/ml and on Caco-2 cells 1,86 ± 0,32 µM /ml) and haemanthamine (IC50 on HT29 cells 2,43 ± 0,13 µM/ml and on Caco-2 cells 0,78 ± 0,18 µM/ml). On the other tested derivatives weren´t demonstrated any cytotoxicity (IC50> 10 µM/ml). Although the IC50 value of less than 10 µM was found for some derivatives, apart from the haemanthamine derivative, there is no significant potential for their eventual use, because they are still not the substances with a significant toxic effect on tumor cell lines.

Keywords

Caco-2, cytotoxicita, Amaryllidaceae

Keywords

Amaryllidaceae, Caco-2, cytotoxicity

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Ivo Doskočil, Ph.D.
• Reader: Ondřej Ženata, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Nutrition and Foodstuffs / Nutrition and Foodstuffs