Komplementový system a optimalizace jeho stanovení u různých živočišných druhů

Bc. Soňa Buchtíková, Ph.D.

Diplomová práce

Complement system and optimalisation of his determine in different animal species

Anotace:

Tato práce byla vypracována za účelem optimalizace stanovení bakteriolytické aktivity komplementu vzorků ryb a savců. Metoda je založená na principu bioluminiscence a byla vyvinuta na spolupracující Department of Biochemistry and Food Chemistry, University of Turku, Finsko. Emise světla je výsledkem reakce enzymu luciferázy a jejího substrátu a vyžaduje přítomnost ATP (adenosin trifosfát), který je produkován pouze živými buňkami. Pro stanovení byl použit rekombinantní bakteriální kmen E. coli, do jehož plasmidu byly vloženy geny kódující enzym luciferázu a jeho substrát luciferin. Naměřené hodnoty bioluminiscence bakterií jsou úměrné jejich viabilitě. Komplement ve vzorku lyzuje bakterie, čím vyšší je jeho aktivita, tím více bakterií je lyzováno. Optimální zjištěné podmínky pro stanovení byly: hustota bakteriální suspenze kmene K12 OD600 = 0,1; přítomnost calf HIS v reakční směsi důležité pro zachování optimální koncentrace proteinů a absorbčních vlastností světla; délka inkubace 3-4 hodiny; inkubační teplota 30oC pro rybí vzorky a 37oC pro savčí vzorky. Metodou byla stanovena aktivita komplementu v séru nebo plasmě kapra, myši, morčete, potkana, kočky, psa, telete a člověka.

Abstract:

The aim of this work was to optimize new method based on the principle of bioluminiscence, which was developed on the Department of Biochemistry and Food Chemistry, University of Turku, Finland. The light emission is a result of the reaction between enzyme luciferase and its substrate and depends on adenosine triphosphate ATP, which is produced only by living cells. In the assay is used recombinant bacterial strain E. coli, which contains reporter genes in the plasmid. The reporter genes code enzyme luciferase and its substrate luciferin. Intensity of bioluminiscence emission is correlated with viability of cells. The optimum conditions for measuring bacteriolytic activity of complement in the fish and mammals samples were: density of bacterial suspension OD600 = 0,1; addition of calf HIS to keep protein concentration and light absorption properties; reaction time 3-4 hours; reaction temperature 30oC for fish samples and 37oC for mammals samples. This method was used to determine activity of classical and alternative pathway of complement in serum or plasma of carp, mice, guinea pig, rat, cat, dog, calf and human.

Klíčová slova

complement system, classical pathway, alternative pathway, lectin pathway, membrane attack complex, bioluminescence, bacteriolytic activity, recombinant bacteria

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 5. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 6. 2007
• Vedoucí: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie