Cell compartmentation and biochemical characterization of maize cytokinin dehydrogenase family

Mgr. David ZALABÁK

Doctoral thesis

Abstract:

Předkládaná disertační práce je zaměřena na katabolismus cytokininů v modelové jednoděložné rostlině kukuřici seté (Zea mays L.) a sestává ze tří částí. První část práce je obecným úvodem do problematiky metabolismu a signálních drah cytokininů. Cílem druhé části práce je biochemická charakterizace jednotlivých isoforem ZmCKX. Za tímto účelem bylo devět ze třinácti ZmCKX heterologně exprimováno v Escherichia coli, následně byly purifikovány pomocí afinitní a iontoměničové chromatografie a podrobeny biochemické charakterizaci. Byla stanovena rychlost enzymatické reakce jednotlivých isoforem, stejně jako jejich substrátová preference. Díky detailní analýze jedné z isoforem, ZmCKX6, byla odhalena důležitost konzervované HFG domény pro normální funkci enzymu. Dále byla studována role jednotlivých isoforem ZmCKX během raného vývoje rostlin kukuřice. Poslední část práce je zaměřena na subcelulární lokalizaci jednotlivých ZmCKX isoforem. Bylo využito několik různých experimentálních přístupů, aby byla odhalena lokalizace jednotlivých ZmCKX. Nejdříve bylo použito imunobarvení v kombinaci s mikroskopickými technikami. Kvůli vysoké míře homologie mezi jednotlivými isoformami ZmCKX a jejich nízké expresi v kukuřičných pletivech bohužel nebylo možné připravit použitelné specifické protilátky. Pro úspěšné stanovení lokalizace ZmCKX proteinů bylo nakonec využito značení pomocí zeleného fluorescenčního proteinu (GFP). Pomocí stabilní exprese fúzních proteinů ZmCKX-GFP v buněčné suspenzní kultuře Arabidopsis thaliana Ler byla odhalena vakuolární lokalizace tří isoforem, ZmCKX2, ZmCKX5 a ZmCKX8. Dále byla potvrzena sekrece isoformy ZmCKX1 do apoplastu.

Abstract:

Presented thesis is aimed on cytokinin catabolism in maize (Zea mays L.) as a monocot model plant and consists of three parts. The first part gives a general introduction to the field of cytokinin metabolism and signaling in plants. The goal of the second part was to characterize the biochemical features of respective ZmCKX isoforms. For this purpose, nine out of thirteen ZmCKXs were heterologously expressed in Escherichia coli, purified by affinity and ion-exchange chromatography and biochemically characterized. The enzyme reaction rates, as well as substrate preference were determined. The detailed study of putatively nonfunctional isoform ZmCKX6 revealed the importance of a conserved HFG domain for enzyme function. The role of respective ZmCKX isoforms during the early development of maize seedling was also studied. The differences in biochemical features of maize and Arabidopsis CKX enzymes are discussed here. The third part of the thesis is focused on subcellular localization of ZmCKX isoforms, where several approaches were applied to reveal the targeting of ZmCKXs. First, immunodetection combined with microscopic techniques was used. However, because of high level of homology among the ZmCKX family members as well as their low abundance in maize tissues, no applicable specific antibodies could be prepared. Protein tagging with green fluorescent protein (GFP) was finally found suitable for the localization of ZmCKX proteins. Stable expression of ZmCKX-GFP fusion proteins in Arabidopsis thaliana Ler cell suspension cultures revealed the localization of three isoforms, ZmCKX2, ZmCKX5 and ZmCKX8, to vacuoles and confirmed ZmCKX1 to be secreted to the apoplast.

Keywords

Zea mays L., cytokinin, cytokinindehydrogenasa, E. coli IMPACT expresní systém, substrátová preference, GFP, buněčná suspenzní kultura Arabidopsis thaliana Ler, subcelulární lokalizace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 11. 2013

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Supervisor: Doc. RNDr. Jitka Frébortová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry