Buněčný lipidom jako diagnostický a prediktivní faktor v normálních a nádorových buněčných populacích

Mgr. Martina Karasová, Ph.D.

Doctoral thesis

The cellular lipidome as diagnostic and predictive factor in normal and tumor cell populations

Abstract:

Karcinom tlustého střeva (CRC) patří mezi nejčastější příčiny úmrtí spojených s onkologickým onemocněním a jeho včasná diagnóza je klíčem k úspěšné terapii. Maligní buněčná transformace je spojena s řadou změn v buněčném metabolismu a vede k aktivaci biosyntetických drah, které zásobují rychle se dělící nádorové buňky potřebnými strukturními, energetickými a signálními molekulami. Aktivace syntézy mastných kyselin (MK) je zásadním bodem metabolické transformace. Nedávné studie naznačily, že nádorová tkáň tlustého střeva se může lišit ve složení MK a lipidů od normální zdravé tkáně. Nicméně analýzy celé nádorové masy obsahující různé buněčné typy nemusí zcela přesně odrážet změny přímo v epiteliálních nádorových buňkách. Proto jsme v naší studii k analýzám buněčného lipidomu (tj. složení MK a lipidů a jejich regulátorů) využili EpCAM pozitivní epiteliální buňky izolované jak z národové, tak zdravé tkáně pacientů s CRC. Hlavním úkolem bylo odhalit změny ve složení lipidů a změny v expresi genů, které zajišťují nebo regulují lipidový metabolismus, a to přímo v epiteliálních buňkách. Výsledky těchto srovnání prokázaly změny v profilech MK a fosfolipidů a zároveň změny v genové expresi enzymů zapojených do syntézy, desaturace a elongace mastných kyselin (stearoyl-CoA desaturáza 1, fatty acid desaturáza 2, fatty acid elongáza 5). V nádorových buňkách byly zjištěny zvýšené hladiny některých více-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem. V analýzách profilů fosfolipidů (PL) a lyso-fosfolipidů (lyso-PL) byl identifikován nárůst tříd obsahujících právě více-nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem. Vzhledem k faktu, že složení membránových fosfolipidů velmi výrazně ovlivňuje vlastnosti a funkce membrány, zabudovávání více-nenasycených mastných kyselin s dlouhým řetězcem do určitých tříd PL a lyso-PL může přispívat ke změnám membránových vlastností a funkcí v nádorových buňkách, a tak i progresi nádorového onemocnění. Jedním z proteinů, které jsou často deregulovány v nádorových buňkách, je receptor pro aromatické uhlovodíky (AhR). Tento transkripční faktor je aktivovaný svými ligandy a reguluje expresi genů pro detoxikační enzymy, jako je rodina cytochromů P450. Přestože je známý především jako xenobiotický senzor zprostředkovávající metabolismus cizorodých látek, současné studie naznačují i jeho zapojení do mnoha endogenních procesů, jako jsou proliferace, diferenciace, migrace a metabolismus. Především vliv AhR na endogenní metabolismus, konkrétně na metabolismus lipidů a mastných kyselin, je jen částečně popsán. Proto jsme se v naší práci soustředili na objasnění úlohy AhR v metabolismu buněk karcinomu tlustého střeva. Analýza hladiny proteinu AhR v pacientských vzorcích prokázala jeho zvýšenou expresi v epiteliálních nádorových buňkách, a to ve srovnání s epiteliálními buňkami izolovanými ze zdravé tkáně. Buněčné linie odvozené od CRC (HCT116 a HT-29) s knock-outovaným AhR genem (AhR KO buňky) vykazovaly nižší úroveň proliferace, která byla dále spojena se změnami v distribuci fází buněčného cyklu. Analýza energetického metabolismu také prokázala sníženou mitochondriální produkci ATP v AhR KO buňkách. Tyto výsledky naznačují zapojení AhR do regulace endogenního metabolismu buněk. Dále jsme se proto zaměřili konkrétně na biosyntetickou dráhu mastných kyselin. Analýza genové exprese klíčových enzymů de novo syntézy mastných kyselin - ACLY (acetyl-CoA lyázy), ACC (acetyl-CoA carboxylázy), FASN (fatty acid syntázy), SCD 1 (stearoyl-CoA desaturázy 1), prokázala jejich sníženou expresi v AhR KO buňkách. Srovnávací analýza MK ve studovaných bu

Abstract:

něčných liniích také naznačila sníženou enzymatickou aktivitu SCD1, vyjádřenou jako poměr mezi produktem a substrátem enzymu (palmitolejovou/palmitovou a olejovou/stearovou kyselinou). Ztráta AhR proteinu v liniích HCT116 a HT-29 byla dále asociována se sníženou expresí a aktivitou dráhy Akt, stejně jako proteinu SREBP1 (sterol regulatory element-binding protein 1), tedy dvou klíčových regulátorů syntézy MK. Studium úlohy AhR v metabolismu nádorových buněk, především v metabolismu mastných kyselin a lipidů, zasluhuje více pozornosti, protože mnoho aspektů funkce AhR zůstává detailněji neobjasněných.

Abstract:

Colorectal cancer (CRC) is the third leading cause of cancer-related deaths worldwide, and early diagnosis is a key to its successful therapy. Cell transformation is associated with a radical modification of cellular metabolism, leading to activation of biosynthetic pathways providing the rapidly dividing cells with necessary structural, energetic and signaling molecules. Activation of lipid biosynthesis, in particular de novo synthesis of fatty acids, is a major step in this metabolic transition. Several studies have suggested differences in specific lipidome profiles, including fatty acid (FA) composition, between colon cancer tissue and the surrounding intestinal mucosa in CRC patients. However, analyses of whole tumor tissue may not always provide an accurate description of the changes occurring directly in tumor epithelial cells. Here, colon epithelial EpCAM+ cells were isolated from tumor and adjacent non-tumor tissues of colon cancer patients. The principal goal was to evaluate changes in lipid composition, as well as changes in expression of genes possibly contributing to altered lipid metabolism, directly in colon tumor epithelial cells. Together with the changes in FA and phospholipid profiles, several enzymes involved in desaturation and elongation of fatty acids (stearoyl-CoA desaturase 1, fatty acid desaturase 2, fatty acid elongase 5), were found to be up-regulated in colon tumor cells, as well as increased mRNA levels key FA synthesis enzymes. The increased levels of FAs in tumor cells included in particular some long polyunsaturated fatty acids. In line with this, the analysis of phospholipid and lysophospholipid profiles revealed several lysophosphatidylcholine and lysophosphatidylethanolamine species, in particular those containing polyunsaturated long chain and very long chain FAs, to be significantly upregulated in colon tumor cells. As the phospholipid composition of cell membrane bilayers determines their properties, the incorporation of polyunsaturated very long chain FAs into specific phospholipid species may contribute to membrane alterations in colon cancer cells. One of the proteins that is upregulated in colon cancer tissue is the aryl hydrocarbon receptor (AhR). This ligand-activated transcription factor is known as xenobiotic sensor and regulates the expression of some detoxifying enzymes (such as cytochrome P450 family 1 enzymes). Nevertheless, numerous studies have indicated that AhR contributes, in addition to its well-known role in control of metabolism of xenobiotics, to regulation of cell proliferation, differentiation, migration, and possibly, also of cellular metabolism. The AhR is frequently found to be deregulated in tumor cells; however, its impact on lipid metabolism is only partially understood. Here, we analyzed the role of AhR in metabolism of colon cancer cell lines, with a particular focus on the genes of FA synthesis. We found the AhR to be overexpressed directly in colon cancer epithelial cells, as compared with cell isolated from healthy tissue. Using wild-type and corresponding AhR knockout (AhR KO) variants of human colon cancer cell HT-29 and HCT116 colon adenocarcinoma cell lines, we found a decreased proliferation rate in AhR KO cell lines that was accompanied with altered cell cycle progression, as well as with reduced mitochondrial production of ATP. When analyzing mRNA levels of key enzymes of FA-biosynthetic pathway - ACLY (acetyl-CoA lyase), ACC (acetyl-CoA carboxylase), FASN (fatty acid synthase), SCD 1 (stearoyl-CoA desaturase 1), we found their expression to be reduced in AhR KO cells. The evaluation of FA content in AhR KO cells indicated that reduced SCD1 levels partially correlated with altered palmitoleic/palmitic and oleic/stearic acid ratios. The loss of AhR was also associated with reduced Akt kinase expression and/or activity, as well as lower expression of SREBP-1 (sterol regulatory element-binding protein 1), two important regulators of lipogenesis. The p

Abstract:

resent data indicate that more attention should be paid to the possible roles of the AhR in both altered proliferation and lipid metabolism in colon tumor cells, as many aspects of the AhR function in tumor cells remain unclear.

Keywords

Lipid metabolism, colorectal cancer, lipidome, de novo synthesis of fatty acids, Aryl Hydrocarbon Receptor Metabolismus lipidů, karcinom tlustého střeva, lipidom, de novo syntéza mastných kyselin, receptor pro aromatické uhlovodíky

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 8. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 9. 9. 2022
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.
• Reader: prof. RNDr. Lenka Skálová, Ph.D., prof. Xavier Coumoul

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology