The role of myeloperoxidase in the regulation of thrombocyte physiology.

Mgr. Hana Kolářová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Ačkoli hlavní úloha trombocytů je zabránění krvácení, trombocyty také přispívají k různým procesům, jež mohou probíhat i nad rámec hemostázy a trombózy. Proto změny ve fyziologických funkcích trombocytů mohou vést až k patogenezi cévních zánětlivých procesů. Zánět je spojen s aktivací krevních neutrofilních granulocytů a uvolněním myeloperoxidázy (MPO) do krevní cirkulace, což může hrát důležitou úlohu při akutních a chronických onemocnění. Všechny současná data naznačují významnou roli MPO v regulaci cévní a krevní homeostázy. Nicméně účinky MPO na trombocyty jako mechanismus přispívající k cévním zánětlivým onemocněním zůstávají neznámé. V této disertační práci byla zkoumána interakce MPO s trombocyty a její vliv na funkci trombocytů. Využitím kombinací různých metod byla prokázána vazba MPO v závislosti na její koncentraci a to jak na lidské tak myší trombocyty. MPO byla detekována na povrchu i uvnitř trombocytů. Na základě inhibice reorganizace cytoskeletu trombocytů jsme prokázaly, že nebyl nutný žádný aktivní transport pro sekvestraci MPO dovnitř trombocytů. Navíc byla prokázána významnost náboje v interakci MPO s trombocyty. Přítomnost MPO u trombocytů byla v přímém kontrastu s absencí MPO u megakaryocytů, prekurzorů trombocytů izolovaných z myší kostní dřeně. MPO vázaná na trombocytech si udržela její enzymatickou aktivitu. Aktivace trombocytů prostřednictvím MPO byla dokumentována zvýšením exprese povrchových receptorů trombocytů, změnou tvaru zastoupenou zvýšením obsahu F-aktinu a zvýšenou tvorbou reaktivních metabolitů kyslíku. Současně MPO vyvolala u trombocytů sníženou produkci oxidu dusnatého. Nicméně, aktivace byla jen částečná, jelikož MPO nevyvolala agregaci trombocytů. Částečná aktivace trombocytů zprostředkovaná MPO byla spojena se zvýšenou interakcí trombocytů s neutrofilními granulocyty a endoteliálními buňkami in vitro. Pro ukázání dopadu změn funkcí trombocytů zprostředkovaných MPO in vivo byl hodnocen čas krvácení z ocasu myši. Infuze MPO indukovala významné zkrácení doby krvácení, což potvrzovalo aktivaci trombocytů prostřednictvím MPO. Avšak použitím MPO deficientních myší nebyly pozorovány žádné významné změny v době krvácení ve srovnání s kontrolními skupinami myší. Na závěr lze předpokládat, že MPO se váže na trombocyty a indukuje u nich aktivovaný stav, což může narušovat jejich fyziologické funkce, které mohou dále modulovat fyziologické funkce cév.

Abstract:

Although the central role of thrombocytes is the prevention of bleeding, they contribute to diverse processes that extend beyond hemostasis and thrombosis. Therefore, alternations in thrombocyte physiological functions can lead to a pathogenesis of vascular inflammatory processes. Inflammation is connected with activation of blood neutrophil granulocytes and with release of myeloperoxidase (MPO) into blood circulation which has been suggested to play important role in acute and chronic vascular diseases. All current data suggest an important role of MPO in regulation of vascular and blood homeostasis. However, MPO effects on thrombocytes as a contributing mechanism to vascular inflammatory diseases remain unknown. In this thesis, the interaction of MPO with thrombocytes and its effects on thrombocyte function were examined. Employing a combination of different methods has shown dose dependent binding of MPO to both human and mouse thrombocytes when MPO was detectable on surface as well as inside the thrombocytes. Based on inhibition of thrombocyte cytoskeleton reorganization, we demonstrated that any active transport for MPO sequestration into thrombocyte would not be required. Moreover, the importance of charge in the interaction of MPO with thrombocytes has been demonstrated. The MPO presence on and in thrombocytes was in direct contrast with absence of MPO in megakaryocytes (MKs), the precursors of thrombocytes isolated from mouse bone marrow (BM). MPO bound to thrombocytes retained its enzymatic activity. An activation of thrombocytes by MPO was documented by MPO mediated increase of an expression of surface thrombocyte receptors, shape change represented by an increased F-actin content and an increased formation of reactive oxygen species (ROS). Simultaneously MPO induced a decrease of nitric oxide production by thrombocytes. However, the activation was only partial as MPO did not induce aggregation of thrombocytes. The partial activation of thrombocytes was connected with MPO mediated increase of thrombocyte interaction with neutrophil granulocytes and endothelial cells (ECs) in vitro. To show the relevance of MPO dependent changes in thrombocyte functions in vivo, bleeding time from mouse tail was evaluated. Infusion of MPO induced significant shortening of bleeding time confirming activation of thrombocytes by MPO. However, employing MPO deficient mice any significant differences in bleeding time compared to wild type control mice was not observed. In conclusion it can be suggested that MPO binds to thrombocytes and induces partial activation status of thrombocytes which can interfere with their physiological functions, which can further modulate physiological functions of blood vessels.

Keywords

Trombocyty, Myeloperoxidáza, Megakaryocyty, Zánět, Reaktivní metabolity kyslíku, Oxid dusnatý, Kardiovaskulární onemocnění, Thrombocytes, Myeloperoxidase, Megakaryocytes, Inflammation, Reactive oxygen species, Nitric oxide, Cardiovascular disease

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 9. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 23. 10. 2012
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: MVDr. Martin Faldyna, Ph.D., doc. RNDr. Antonín Lojek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology