Mechanismy regulace procesování pre-mRNA prostřednictvím posttranskripčních modifikací

Mgr. Veronika Šemberová Rájecká, Ph.D.

Disertační práce

Mechanisms of pre-mRNA processing by posttranscriptional modifications

Anotace:

Modifikace a procesování RNA jsou jedny z klíčových kroků regulace eukaryotické genové exprese. Po transkripci RNA polymerázou II prochází molekuly RNA několika kotranskripčními procesy. Mezi ně patří přidání 5' čepičky k nově syntetizované molekule, sestřih intronů pomocí spliceozomu a nakonec štěpení nebo disociace molekuly RNA z transkribující RNA polymerázy II. Následně je volný 3' konec polyadenylován pomocí poly(A) polymeráz. Tento proces ovlivňuje stabilitu a degradaci molekul RNA. Mezi modifikace RNA, které významně ovlivňují metabolismus RNA, patří netemplátové přidání nukleotidů k 5' a 3' koncům RNA a interní modifikace RNA, jako jsou m6A a m6Am. Tato disertační práce se zaměřuje na funkce m6A, m6Am a 3' polyadenylace v buňce a proteiny které tyto modifikace přidávají, odebírají a rozpoznávají. První část výsledků ukazuje již publikovanou práci (Stejskal et al. 2025). V této studii představujeme metodu pro přesné stanovení a kvantifikaci chemických modifikací kódujících a nekódujících RNA pomocí LC-MS/MS. Následně jsme tuto metodu využili k osvětlení dynamiky modifikací RNA, m6A a m6Am, v lidských buňkách. Prokázali jsme, že příslušné demetylázy. ALKBH5 a FTO, mají pouze mírný vliv na jejich stálou úroveň v mRNA, což je v rozporu s dlouhodobou hypotézou, kde je m6A dynamickou značkou mRNA. Druhá část této práce představuje výzkum role koncových modifikací na 3' konci RNA zprostředkovaných komplexem TRAMP4 v Saccharomyces cerevisae. TRAMP4 je dobře známým faktorem kontroly nad jadernými aberantními nekódujícími RNA. Zde ukazujeme novou funkci komplexu TRAMP4 při tvorbě správných 3' konců transkriptů kódujících proteiny. Tyto výsledky jsou prezentovány ve formě rukopisu. Třetí část této disertační práce představuje výsledky ze dvou stále probíhajících kolaborativních projektů. Cílem prvního projektu je objasnění role proteinu FTO a RNA modifikací m6A a m6Am v regulaci alternativního sestřihu a procesování snRNA. Druhý projekt shrnuje vliv nového inhibitoru FTO na hladinu modifikací m6A a m6Am a souvisejících regulačních proteinů v T-buněčné akutní lymfoblastické leukémii.

Abstract:

RNA processing and modifications represent critical parameter in the regulation of eukaryotic gene expression. Following transcription by RNA polymerase II, diverse RNAs undergo several co-transcriptional processes. These include the addition of a 5' cap to the nascent molecule, intron removal by the spliceosome complex, and, finally, cleavage or dissociation from the transcribing RNA polymerase II. Subsequently, the 3' terminus is polyadenylated by poly(A) polymerases, a process that influences RNA molecule stability or decay. The critical modifications that significantly contribute to mRNA metabolism include 5' and 3' non-templated nucleotide additions and internal modifications such as m6A and m6Am. This Ph.D. thesis specifically focusses on cellular functions of m6A, m6Am, and 3' RNA tailing, and on the factors responsible for depositing, removing and recognising these modifications. The first results part contains our published work (Stejskal et al. 2025). In this study, we established an unbiased determination and quantification of multiple chemical modifications of coding and non-coding RNAs by LC-MS/MS. Subsequently, we applied this method to tackle the dynamics of m6A and m6Am in RNA of human cells. We demonstrated that the corresponding demethylases, ALKBH5 and FTO, exert only a modest effect on m6A levels in steady state mRNAs which contradicted the long-standing vision of m6A as a dynamic mark of mRNAs. Second part of the thesis presents our investigation into the role of 3' end tailing mediated by the TRAMP4 complex in Saccharomyces cerevisiae. TRAMP4 is a well-established surveillance factor for nuclear aberrant non-coding RNAs. Here, we report a novel function for the TRAMP4 complex in the formation of proper 3' termini of protein-coding transcripts. These findings are presented in a form of a manuscript. The third section presents results from two ongoing collaborative projects. One project elucidates the role of the human m6A demethylase FTO in the regulation of alternative splicing and snRNA processing. The second project investigates the impact of a novel FTO inhibitor on the levels of m6A and m6Am, and the associated regulatory proteins, in T-cell acute lymphoblastic leukaemia.

Keywords

modifikace RNA, procesování RNA, 3′ procesování RNA, RNA methyltransferáza, RNA demetyláza, nekanonická poly(A) polymeráza, m6A, m6Am, polyadenylace, FTO, ALKBH5, Trf4p, TRAMP complex, Saccharomyces cerevisiae RNA modification, RNA processing, 3′end processing, RNA methyltransferase, RNA demethylase, non-canonical poly(A) polymerase, polyadenylation, Saccharomyces cerevisiae

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 3. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 4. 2025
• Vedoucí: prof. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Oponent: prof. Mgr. David Staněk, Ph.D., Ph.D. Lidia Vasilieva, Dr. rer. nat. Leoš Valášek, DSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě