Proteiny odpovědné za špatnou terapeutickou odpověď metastatických nádorů ledvin

Bc. Jan Šimoník

Master's thesis

Proteins responsible for poor therapy outcome of metastatic renal cell carcinomas

Abstract:

Metastatický karcinom ledvin (mRCC) představuje nádorové onemocnění s velmi špatnou prognózou. Pacienti s mRCC jsou typicky léčeni tyrosinkinázovými inhibitory (TKI), nicméně mnoho pacientů na tuto léčbu odpovídá špatně nebo vůbec. V současné době chybí molekulární markery, které by odhalily pacienty, kteří by lépe odpovídali na alternativní léčbu (imunoterapie, klinická studie). Cílem této práce bylo na základě proteomové analýzy identifikovat proteiny mající zvýšenou hladinu u metastatických nádorů ledvin neodpovídajících na léčbu oproti odpovídajícím. Proteomová analýza 85 mRCC tkání od pacientů léčených TKI sunitinibem a pazobanibem v 1. linii, z nichž část neodpovídala na léčbu, a 17 přilehlých nenádorových linií, odhalila jako možného kandidáta protein GPNMB. Pomocí metody CRISPR/Cas 9 byly z buněčné linie 786-0, odvozené z renálního karcinomu, připraveny klony s umlčeným GPNMB genem. Celkově bylo připraveno 69 klonů, u kterých byla následně stanovena hladina GPNMB pomocí western blotu s imunochemickou detekcí. 11 klonů mělo sníženou expresi GPNMB a byla u nich provedena sekvenace DNA. Pouze u klonu 786-0 GPNMB exon 1 D7 byla zjištěna konkrétní modifikace a to delece 10 bp, která vedla k frameshiftu a vnesení stop kodonu. Vliv snížené exprese GPNMB u klonu 786-0 GPNMB exon 1 D7 byl následně studován ve „scratch“ migračních experimentech. Výsledky ukázaly, že klon 786-0 GPNMB exon 1 D7 měl sníženou migrační schopnost oproti rodičovské linii 786-0. Celkově lze shrnout, že hladina proteinu GPNMB na studovaném souboru souvisí s odpovědí na léčbu TKI a migrační kapacitou nádorových buněk. Použité moderní přístupy bioinformatiky, molekulární a buněčné biologie nacházejí uplatnění rovněž v široké škále biomedicínských a biotechnologických aplikací.

Abstract:

Metastatic renal cell carcinoma (mRCC) represents a cancer disease with very poor prognosis. mRCC patients have been typically treated by tyrosine kinase inhibitors (TKI), however, many patients respond poorly, or do not respond to this treatment. Nowadays there are no molecular markers which could identify patients who would benefit from an alternate treatment (e.g., immunotherapy or clinical trial). This thesis aimed to identify and characterize proteins elevated in mRCC tissues non-responding to TKI compared to their responding counterparts. Proteomics analysis of 85 mRCC primary tumors from patients treated with TKI sunitinib and pazopanib, the part of which did not respond to this treatment, and of additional 17 adjacent non-cancerous lines revealed GPNMB as a suitable candidate protein. The clones with knock-outed GPNMB were prepared from 786-0 RCC-derived cell line using CRISPR/Cas9 method. In total 69 clones were obtained, and GPNMB level was compared using western blotting and immunochemistry. 11 clones had lower GPNMB expression and DNA sequencing was performed. Only the clone 786-0 GPNMB exon 1 D7 had a specific modification - deletion of 10 bp which led to frameshift and stop codon introduction. The effect of GPNMB loss in clone 786-0 GPNMB exon 1 D7 was tested by scratch migration assay. The data showed that clone 786-0 GPNMB exon 1 D7 migrated slower than parental 786-0 cell line. In a summary, higher GPNMB levels were related to a poor response to TKI in our cohort of patients and to increased migration capacity of cancer cells. The modern approaches of bioinformatics, molecular and cellular biology used in the study has a great potential in a wide range of biomedical and biotechnological applications.

Keywords

CRISPR/Cas9, GPNMB, renální karcinom, migrace, renal cell carcinoma, migration

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2022
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Reader: MUDr. Petr Müller, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biotechnology / Biotechnology